Tutti gli articoli di Dr. Nicola Tazzini

Nicola Tazzini, Biologo Il Dott. Tazzini si è laureato con lode all’Università degli Studi di Pisa l’undici novembre del 1996 dopo aver svolto l’internato di tesi nel laboratorio di Biochimica del Dipartimento di Fisiologia e Biochimica della Facoltà di Scienze Naturali, Fisiche e Matematiche della medesima Università. L’argomento della tesi è stato: “Studi sul meccanismo di citotossicità della combinazione di deossiadenosina e deossicoformicina su una linea cellulare derivante da carcinoma del colon umano” (vedi Bibliografia). Ha superato l’esame di stato per l’abilitazione alla professione di Biologo presso l’Università degli Studi di Pisa il 10 maggio del 1998. Si è specializzato con lode in Biochimica e Chimica Clinica il 3 ottobre del 2001 presso il Dipartimento di Chimica Biologica della Facoltà di Medicina e Chirurgia dell’Università degli Studi di Parma. L’argomento della tesi era: “Analisi dei parametrici ematochimici, enzimatici e non enzimatici, ad attività antiossidante in giovani atleti professionisti”. Ha iniziato l’attività di Nutrizionista (libera professione) il 2 febbraio del 2002. Corsi relativi all'attività di Nutrizionista seguiti dal 2000 al 2016. 2000 1. La pasta nell'alimentazione umana. Ancona 28 ottobre 2000. Associazione Biologi Nutrizionisti Italiani (di seguito A.B.N.I.). 2. Corso di formazione ed aggiornamento in nutrizione e salute: il ruolo del Biologo. Associazione Scientifica Biologi Pisa. 2001 Elementi di nutrizione. Associazione Scientifica Biologi Pisa. 2002 L’alimentazione come fattore di salute: aspetti metodologici e aggiornamento professionale. A.B.N.I. 2003 Alimentazione come fattore di salute - parte I. A.B.N.I. 2004 1. Alimentazione come fattore di salute - parte II. A.B.N.I. 2. Alimentazione ed età evolutiva. A.B.N.I. 3. Attività sportiva, accrescimento e corretta alimentazione. A.B.N.I. 4. Nutrizione e tumori. Prevenzione e stili di vita. PLANNING congressi Srl. 2005 1. “Il doping”. Linee guida e percorsi diagnostici: aspetti giuridici, biochimici, medici e tossicologici. Restless Architech of Human Possibilities S.a.s. 2. L’alimentazione nella terza età: problematiche nutrizionali e corretto stile alimentare. A.B.N.I. 3. Evoluzione tecnico-normativa ed etica nello sviluppo della professione. Ordine Nazionale dei Biologi (di seguito O.N.B.). 2006 1. Sport e nutrizione. Syntonie S.r.l. 2. Alimentazione e prevenzione: scegliere per stare bene. O.N.B. 3. Patologia, nutrizione e aspetti legislativi. Syntonie S.r.l. 4. Nutrizione: linee guida. O.N.B. 2007 Argomenti di nutrizione. Alimenti come strumenti di salute e benessere. O.N.B. 2008 1. Ambiente esterno ed indoor. Risorse ed equilibri. O.N.B. 2. La professione del Biologo nell'attuale evoluzione tecnico normativa. O.N.B. 3. Prevenzione dell’obesità infantile: strategie nutrizionali dalla gravidanza all’età scolare. O.N.B. 2009 Nutrizione, la pietra d’angolo. Fabbisogni nutrizionali e salute nell’epoca del genoma. S.I.N.U. 2010 1. L’evoluzione della sicurezza alimentare. O.N.B. 2. Sicurezza alimentare e corretta nutrizione. Associazione Scientifica Biologi Pisa ed O.N.B. 2011 Ruolo del caffè negli stati fisiologici e patologici. CMGRP Italia S.p.A. 2012 1. Nutrigenetica ed obesità. A.I.Nu.C. S.r.l. 2. Il senso della danza ormonale nella complessità del femminile: il ruolo dell’alimentazione. A.I.Nu.C. S.r.l. 3. Nutrizione nello sport: dall’allenamento al recupero post-gara. DocLeader S.r.l. 2013 1. Interpretazione delle analisi cliniche e consigli nutrizionali. A.I.Nu.C. S.r.l. 2. L’alimentazione nelle patologie cardiovascolari: prevenzione e strategie nutrizionali. Akesios group s.r.l. 3. Il corretto uso dei probiotici. ALFA FCM S.r.l. 2014 1. L’alimentazione nelle patologie metaboliche. Prevenzione e strategie nutrizionali. A.C.S.I.A.N. 2. I disturbi glutine correlati: inquadramento, diagnosi, terapia. DNA Medical Communication 3. Nutrizione e laboratorio. Allmeetings S.r.l 4. La salute passa per l’intestino: il ruolo della permeabilità intestinale. A.I.Nu.C. S.r.l. 2015 1. The best way per il biologo professionista. Provider Dynamicom Education S.r.l. 2. Gonfiore e discomfort addominale: intolleranza al lattosio, SIBO e sindrome dell’intestino irritabile. Allmeetings S.r.l. 2016 Alimentazione consapevole e sana nutrizione avente come obiettivo didattico/formativo generale: sicurezza alimentare e/o patologie correlate. B.B.C. By Business Center S.r.l. 2017 La Medicina di Genere: oltre la pillola rosa e la pillola blu. FIB - Fondazione Italiana Biologi 2018 La comprensione del paziente: dalla composizione corporea agli aspetti nutrizionali in condizioni fisio-patologiche. AKESIOS GROUP s.r.l. Bibliografia 1. Bemi V., Tazzini N., Banditelli S., Giorgelli F., Pesi R., Turchi G., Mattana A., Sgarrella F., Tozzi M.G., Camici M. Deoxyadenosine metabolism in a human colon-carcinoma cell line (LoVo) in relation to its cytotoxic effect in combination with deoxycoformycin. Int J Cancer 1998;75(5):713-20. doi:https://doi.org/10.1002/(SICI)1097-0215(19980302)75:53.0.CO;2-1 2. Cassandra Studio . Nutraceuti e cibi funzionali. Youcanprint, 2015 3. Singh A.N., Baruah M.M. & Sharma N. Structure based docking studies towards exploring potential anti-androgen activity of selected phytochemicals against prostate cancer. Sci Rep 2017;7(1):1955. doi:10.1038/s41598-017-02023-5 4. 3. Wee T.T., Lun K.R. Teaching science in culturally relevant ways: ideas from Singapore teachers. World Scientific, 2014

Resa energetica del glicogeno

Il glicogeno è, con lipidi, un riserva di energia cui l’organismo può attingere nel momento del bisogno. Sebbene quantitativamente inferiore rispetto ai lipidi, il glicogeno ha alcuni vantaggi metabolici.

  • E’ mobilizzato più velocemente rispetto ai lipidi.
  • E’ una riserva di glucosio cui attingere per mantenere entro l’intervallo di normalità la glicemia nel digiuno, durante l’attività fisica e tra i pasti.
  • Può essere utilizzato come fonte di energia sia in condizioni aerobiche che in condizioni anaerobiche.

Considerando l’ultimo punto, la resa energetica del glucosio rilasciato dal glicogeno è differente in condizioni anerobiche ed aerobiche. Di seguito si analizzeranno le basi metaboliche di queste differenze.
INDICE

Resa energetica del glicogeno in condizioni anaerobiche

In condizioni anaerobiche, l’ossidazione di una molecola di glucosio a lattato attraverso la glicolisi anaerobica porta alla produzione di due molecole di ATP.
Di seguito viene analizzata la resa in ATP dall’ossidazione anaerobica del glucosio rilasciato dal glicogeno per azione della glicogeno fosforilasi (EC 2.4.1.1), che porta alla liberazione di circa il 90% del glucosio immagazzinato in forma di glucosio-1-fosfato, abbreviato G-1-P, e dell’enzima deramificante (EC 3.2.1.33), responsabile del rilascio del restante 10% delle unità monosaccaridiche in forma non fosforilata, quindi come glucosio.

Glicogeno fosforilasi e ossidazione del G-1-P in condizioni anaerobiche

La sintesi del glicogeno dal glucosio comporta il consumo di due molecole di ATP per ogni molecola immagazzinata.
Il rilascio di una molecola di glucosio-1-fosfato per azione della glicogeno fosforilasi permette il risparmio di una delle due molecole di ATP utilizzate nella fase preparatoria della glicolisi. L’ossidazione anaerobica del glucosio-6-fosfato, prodotto dal glucosio-1-fosfato nella reazione catalizzata dalla fosfoglucomutasi (EC 5.4.2.2), porta alla produzione di tre molecole di ATP e non due, in quanto:

  • nella fase preparatoria della glicolisi è consumata una molecola di ATP e non due, essendo bypassata la reazione catalizzata dalla esochinasi (EC 2.7.1.1);
  • quattro molecole di ATP sono prodotte nella fase di recupero energetico della glicolisi.

Il rapporto spesa-guadagno è 1/3, quindi si ha una resa energetica di circa il 66,7%.
La reazione complessiva è:

Glicogeno(n residui di glucosio) + 3 ADP + 3 Pi → Glicogeno(n-1 residui di glucosio) + 2 Lattato + 3 ATP

Considerando le due molecole di ATP spese nel corso della sintesi del glicogeno e l’ossidazione anaerobica del glucosio-1-fosfato a lattato, si ha una resa pari ad una molecola di ATP per molecola di glucosio immagazzinata.
La reazione complessiva è:

Glucosio + ADP + Pi → 2 Lattato + ATP

Enzima deramificante e ossidazione del glucosio in condizioni anaerobiche

Considerando il glucosio liberato per azione dell’enzima deramificante, la resa in ATP è pari a zero in quanto:

Se ora si considera l’ossidazione sino a lattato di tutto il glucosio provenienti dal glicogeno si ha una resa energetica pari a:

1-{[(1/3)*0,9]+[(2/2)*0,1]}=0,60

Ne consegue che in condizioni anaerobiche, si ha una resa energetica pari al 60%, e quindi il glicogeno rappresenta una buona forma di riserva di energia.

Resa energetica del glicogeno in condizioni aerobiche

In condizioni aerobiche, l’ossidazione di una molecola di glucosio a CO2 e H2O attraverso glicolisi, complesso della piruvato deidrogenasi, ciclo di Krebs, catena di trasporto degli elettroni mitocondriale e fosforilazione ossidativa porta alla produzione di circa 30 molecole di ATP.
Di seguito viene analizzata la resa in ATP dall’ossidazione aerobica del glucosio rilasciato dal glicogeno per azione della glicogeno fosforilasi e dell’enzima deramificante.

Glicogeno fosforilasi e ossidazione del G-1-P in condizioni aerobiche

Dall’ossidazione del glucosio-6-fosfato, prodotto dal glucosio-1-fosfato per azione della fosfoglucomutasi, a CO2 e H2O si ottengono 31 molecole di ATP e non 30, grazie all’ATP risparmiato nella fase preparatoria della glicolisi. Dunque, il rapporto spesa-guadagno è di 1/31, con una resa energetica di circa il 97%.
La reazione complessiva è:

Glicogeno(n residui di glucosio) + 31 ADP + 31 Pi → Glicogeno(n-1 residui di glucosio) + 31 ATP + 6 CO2 + 6 H2O

Considerando le due molecole di ATP spese per molecola di glucosio immagazzinata nel glicogeno e l’ossidazione aerobica del glucosio-1-fosfato a CO2 e H2O, si ha una resa pari a 29 molecole di ATP per unità di glucosio immagazzinata.
La reazione complessiva è:

Glucosio + 29 ADP + 29 Pi → 29 ATP + 6 CO2 + 6 H2O

Enzima deramificante e ossidazione del glucosio in condizioni aerobiche

Considerando le unità di glucosio liberate dall’enzima deramificante, la resa in ATP è pari a 30 molecole in quanto la fase preparatoria della glicolisi comporta la spesa di due molecole di ATP. Quindi, il rapporto spesa-guadagno è 2/30, con una resa energetica di circa il 93,3%.
Se ora si considera l’ossidazione a CO2 e H2O di tutte le unità di glucosio provenienti dal glicogeno, si ha una resa energetica pari a:

1-{[(1/31)*0,9]+[(2/30)*0,1]}=0,96

Resa energetica glicogeno condizioni anaerobiche aerobiche
Ne consegue che, in condizioni aerobiche, si ha una resa energetica pari al 96%, e quindi il glicogeno rappresenta una forma di riserva di energia estremamente efficiente, con un guadagno del 36% rispetto alle condizioni anaerobiche.

Bibliografia

Nelson D.L., Cox M.M. Lehninger. Principles of biochemistry. 6th Edition. W.H. Freeman and Company, 2012

Stipanuk M.H., Caudill M.A. Biochemical, physiological, and molecular aspects of human nutrition. 3rd Edition. Elsevier health sciences, 2013 [Google eBooks]

Voet D. and Voet J.D. Biochemistry. 4th Edition. John Wiley J. & Sons, Inc. 2011

Sistema RS

Nel 1956, Robert Sidney Cahn, Christopher Ingold, e Vladimir Prelog misero a punto un sistema di nomenclatura che, basandosi su poche e semplici regole, permette di assegnare la configurazione assoluta ad ogni centro chirale presente in una molecola.
Questo sistema di nomenclatura, chiamato sistema RS o convenzione di Cahn-Ingold-Prelog, quando accoppiato con il sistema di nomenclatura IUPAC, permette di assegnare in maniera accurata e priva di ambiguità il nome alle molecole chirali, anche quando è presente più di un centro asimmetrico.
Le molecole chirali sono, nella maggior parte dei casi, in grado di far ruotare il piano della luce polarizzata quando questa attraversa una soluzione che le contenga. A questo riguardo va sottolineato che il segno del potere rotatorio non da alcuna informazione circa la configurazione RS dei centri chirali della molecola.
La convenzione di Fischer-Rosanoff è un altro sistema di nomenclatura per le molecole chirali. Tuttavia, rispetto al sistema RS, non analizza ogni singolo centro chirale ma assegna un nome all’intera molecola, e spesso presenta ambiguità con molecole con più centri chirali.

INDICE

Le regole di priorità del sistema RS

Il sistema RS assegna un ordine di priorità ai gruppi legati ad un centro chirale e, tracciando una circonferenza dal gruppo a priorità maggiore verso quello a priorità minore, assegna la configurazione R o S al centro chirale.

Prima regola

Si assegna un ordine di priorità ai gruppi, sulla base del numero atomico dell’atomo direttamente legato al centro chirale.

  • L’atomo con il numero atomico più alto ha la priorità più alta.
  • L’atomo con il numero atomico più basso ha la priorità più bassa.

Ad esempio, se un atomo di ossigeno, O, numero atomico 8, di carbonio, C, numero atomico 6, di cloro, Cl, numero atomico 17, e di bromo, Br, numero atomico 35, sono legati ad un centro chirale, l’ordine di priorità sarà: Br > Cl> O > C.
Considerando gli isotopi, l’atomo con la massa atomica più alta ha la priorità più alta.

Seconda regola

Quando gruppi differenti sono legati al centro di chiralità attraverso identici atomi, l’ordine di priorità è assegnato in base al numero atomico dell’atomo successivo a quello legato al centro, allontanandoci dal centro chirale finché non si raggiunge il primo punto di differenza.
Se, per esempio, i gruppi –CH3, –CH2CH3 e –CH2OH sono legati al centro di chiralità, ci sono tre atomi identici attaccati direttamente ad esso. Analizzando gli atomi successivi, si ha:

  • per il gruppo metilico –CH3
H, H, H
  • per il gruppo etilico –CH2CH3
H, H, C
  • per il gruppo idrossimetilico –CH2OH
H, H, O

Sistema RS assegnazione ordine di priorità: prima regolaPoiché il numero atomico dell’atomo di ossigeno è maggiore di quello dell’atomo di carbonio, che a sua volta è maggiore di quello dell’atomo di idrogeno, l’ordine di priorità sarà –CH2OH > –CH2CH3 > –CH3.
Per alcuni gruppi l’ordine di priorità è il seguente:

–I > –Br > –Cl > –SH > –OR > –OH > –NHR > –NH2 > –COOR > –COOH > –CHO > –CH2OH > –C6H5 > –CH3 > –2H > –1H

Si noti che i gruppi legati ad un centro chirale devono avere un differente grado priorità altrimenti il centro non può essere chirale.

Stabilito l’ordine di priorità, si orienta la molecola nello spazio in modo che il gruppo a priorità più bassa sia diretto in direzione opposta a quella dell’osservatore, quindi dietro il centro chirale. A questo punto si congiungono i gruppi rimasti con una circonferenza, in modo che la successione sia secondo priorità decrescente: dal gruppo a priorità più alta verso quello a priorità più bassa.

  • Se tracciando questa circonferenza si segue una direzione oraria, la configurazione del centro chirale è R, dal latino rectus che significa “destra”.
  • Se tracciando la circonferenza si segue una direzione antioraria, la configurazione del centro chirale è S, dal latino sinister che significa “sinistra”.

Centro chirale configurazione R

Terza regola

Questa può essere considerata come la terza regola del sistema RS, grazie alla quale è possibile assegnare la configurazione ad un centro chirale anche quando sono presenti di doppi o tripli legami nei gruppi legati al centro stesso.
Ai fini dell’attribuzione delle priorità, gli atomi impegnati nei legami multipli sono considerati duplicati, nel caso di un doppio legame, e triplicati, nel caso di un triplo legame.
Sistema RS assegnazione ordine di priorità: terza regola
Nel caso di doppio legame C=Y, un atomo Y sarà da legare sull’atomo di carbonio, e un atomo di carbonio sull’atomo Y.
Nel caso di un triplo legame C≡Y, due atomi Y verranno legati sull’atomo di carbonio, e due atomi di carbonio sull’atomo Y.

Sistema RS in presenza di più centri chirali

Quando in una molecola sono presenti due o più centri chirali, si procede analizzando in modo indipendente ciascun centro, utilizzando le regole viste in precedenza.
Consideriamo il 2,3-butandiolo. La molecola ha due centri chirali, il carbonio 2 ed il carbonio 3, e tre stereoisomeri: due enantiomeri ed un composto meso. Qual è la configurazione RS dei centri chirali dell’enantiomero in figura?

Configurazione RS centri chirali (2R,3R)-2,3-butandioloSi consideri il carbonio 2. L’ordine di priorità dei gruppi legati è: –OH > –CH2OHCH3 > –CH3 > –H. Si ruoti la molecola in modo che l’idrogeno, il gruppo con la priorità più bassa, sia diretto in direzione opposta all’osservatore. Disegnando una circonferenza partendo dal gruppo –OH, il gruppo con la priorità più alta, verso il gruppo –CH3, il gruppo a priorità più bassa, ci si muove in senso antiorario, per cui la configurazione del carbonio 2 è R. Applicando la stessa procedura al carbonio 3, si scopre che la sua configurazione è R. Quindi l’enantiomero in figura è il (2R,3R)-2,3-butandiolo.

Aminoacidi e gliceraldeide

Nella convenzione di Fischer-Rosanoff tutti gli aminoacidi proteinogenici sono L-aminoacidi. Nel sistema RS, con l’eccezione della glicina che è achirale, e della cisteina che, per la presenza del gruppo tiolico è la (R)-cisteina, tutti gli altri aminoacidi proteinogenici hanno configurazione S.
La treonina e l’isoleucina posseggono due centri chirali, il carbonio alfa ed un atomo di carbonio sulla catena laterale, e tre stereoisomeri: due enantiomeri ed un composto meso. Le forme dei due amminoacidi isolate dalle proteine sono la (2S,3R)-treonina e la (2S,3S)-isoleucina, secondo la convenzione di Fischer-Rosanoff la L-treonina e la L-isoleucina.
Nel sistema RS, la L-gliceraldeide ha il centro chirale con configurazione S, per cui è indicata come (S)-gliceraldeide; ovviamente la D-gliceraldeide sarà la (R)-gliceraldeide.

Bibliografia

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Prelog V. and Helmchen G. Basic principles of the CIP‐system and proposals for a revision. Angew Chem 1982:21(8);567-83. doi:10.1002/anie.198205671

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Voet D. and Voet J.D. Biochemistry. 4th Edition. John Wiley J. & Sons, Inc. 2011

Chiralità

La definizione di chiralità, dal greco cheir che significa “mano”, si deve a Lord Kelvin che la enunciò nel corso delle “Baltimore Lectures”, una serie di lezioni tenute alla Johns Hopkins University di Baltimora a partire dal primo ottobre del 1884, e pubblicate venti anno dopo, nel 1904, in cui lo scienziato inglese, tra le altre cose, affermava: “I call any geometrical figure, or groups of points, chiral, and say it has chirality, if its image in a plane mirror, ideally realized, cannot be brought to coincide with itself”.
Lord Kelvin e la Definizione di ChiralitàDunque, la chiralità è la proprietà geometrica di un insieme di punti o atomi nello spazio, o di oggetti solidi, di non essere sovrapponibili alla loro immagine speculare. Questi strutture, definite chirali, hanno la caratteristica peculiare di essere prive di elementi di simmetria del secondo ordine, ossia un piano di simmetria, un centro di inversione, o un asse di roto-riflessione.
L’ambiente che ci circonda è ricco di oggetti chirali: le nostre mani ne sono l’esempio per eccellenza, ma ce ne sono moltissimi altri, dal guscio di una chiocciola sino ad una galassia a spirale. In chimica, e in special modo in chimica organica, la chiralità è una proprietà di importanza primaria, in quanto molecole come i carboidrati, molti amminoacidi, nonchè moltissimi farmaci, sono chirali.
Le molecole chirali possono esistere in due forme, l’una immagine speculare dell’altra e non sovrapponibili, ossia, non esiste una combinazione di rotazioni o traslazioni sul piano del foglio che consenta la loro sovrapposizione. Queste molecole sono dette enantiomeri, dal greco enántios che significa “contrario” e meros che significa “parte”.
La causa più comune di chiralità in una molecola è la presenza di un centro di chiralità o centro chirale, anche detto centro asimmetrico, cioè un atomo che leghi un insieme di ligandi disposti nello spazio in modo che la molecola risultante possa esistere come due enantiomeri.
Gli enantiomeri a loro volta sono un tipo di stereoisomeri, i quali possono essere definiti come isomeri che hanno lo stesso numero e tipo di atomi e legami, ma che differiscono nell’orientamento spaziale degli atomi.

INDICE

Gli enantiomeri

Due enantiomeri di una molecola chirale, non essendo sovrapponibili, sono composti differenti. In che cosa differiscono?
Ciascuna coppia di enantiomeri possiede identiche proprietà fisiche e chimiche verso tutto ciò che non è chirale come il punto di fusione, il punto di ebollizione, l’indice di rifrazione, lo spettro infrarosso, la solubilità in uno stesso solvente, o la velocità di reazione con i reagenti achirali.
Le differenze emergono quando la coppia enantiomerica viene fatta interagire con fenomeni chimici e fisici che abbiano natura chirale.

  • Dal punto di vista chimico, due enantiomeri possono essere distinti quando si trovano ad interagire con strutture chirali, come il sito di legame di un recettore chirale o il sito attivo di un enzima chirale.
  • Dal punto di vista fisico due enantiomeri differiscono nelle interazioni con la luce polarizzata, che ha proprietà chirali, sono cioè dotati di attività ottica.

Chiralità ed attività ottica

L’attività ottica di materiali come il quarzo e, più importante, di composti organici come zuccheri o l’acido tartarico, fu scoperta nel 1815 dallo scienziato francese Jean-Baptiste Biot.
Le molecole chirali possono essere classificate sulla base della direzione in cui viene ruotato il piano della luce polarizzata quando attraversa una soluzione che le contenga.

  • Se una soluzione di un enantiomero ruota il piano della luce polarizzata in senso orario dal punto di vista dell’osservatore, la molecola viene definita destrogira o destrorotatoria, dal latino dexter che significa “destro”, ed suo nome è preceduto dai prefissi (+), o d, da dextro-.
  • Se una soluzione di un enantiomero ruota il piano della luce polarizzata in senso antiorario dal punto di vista dell’osservatore, la molecola è definita levogira o levorotatoria, dal latino laevus che significa “sinistro”, ed il suo nome è preceduto dai prefissi (-), o l, da laevo-.

Ovviamente, considerando una coppia di enantiomeri, uno sarà destrogiro e l’altro non potrà che essere levogiro.
Al momento non è ancora possibile predire in modo affidabile ne la grandezza, la direzione, o il segno della rotazione del piano della luce polarizzata indotta da un enantiomero. D’altro canto, neppure l’attività ottica di una molecola da alcun tipo di informazione riguardo alla disposizione spaziale dei gruppi chimici legati al centro di chiralità.
Nota: un sistema contenente molecole che abbiamo lo stesso senso di chiralità è chiamato enantiomericamente puro o enantiopuro.

Pasteur e la scoperta degli enantiomeri

Louis Pasteur e la scoperta degli enantiomeriNel 1848, trentatre anni dopo il lavoro di Biot, studi sull’attività ottica delle molecole portarono Louis Pasteur, che di Biot era stato studente, a notare che, a seguito della ricristallizzazione di una soluzione acquosa concentrata di sodio ammonio tartrato, di per se otticamente inattiva, precipitavano due tipi di cristalli che erano l’uno l’immagine speculare dell’altro e non sovrapponibili. Dopo averli separati con delle pinzette, Pasteur si accorse che le soluzioni ottenute sciogliendo quantità equimolari dei due cristalli erano otticamente attive e, cosa forse più interessante, l’angolo di rotazione del piano della luce polarizzata era lo stesso ma di segno opposto. Poiché queste differenze nell’attività ottica erano dovute alle molecole di sodio ammonio tartrato disciolte, Pasteur ipotizzò che le molecole stesse dovessero essere l’una l’immagine speculare dell’altra e non sovrapponibili, al pari dei loro cristalli, quelli che oggi chiamiamo enantiomeri. E fu Pasteur che per primo coniò il termine asimmetria per descrivere questa proprietà, definita in seguito chiralità da Lord Kelvin.

Miscele racemiche

Una soluzione che contenga quantità equimolari di ciascun membro di una coppia di enantiomeri è detta miscela racemica o racemo. Queste soluzioni sono otticamente inattive in quanto l’effetto rotatorio di un enantiomero è esattamente compensato da quello dell’altro enantiomero.
A differenza di quanto accade nei processi biochimici, la sintesi chimica di molecole chirali che non preveda il ricorso a reagenti chirali, o che non sia seguita da metodiche di separazione degli enantiomeri, porta inevitabilmente alla produzione di una miscela racemica.
Il settore che più a risentito di questo fenomeno è quello della chimica farmaceutica. Come detto in precedenza, due enantiomeri sono molecole differenti. Molti farmaci chirali sono sintetizzati come miscele racemiche, ma molto spesso l’attività farmacologica desiderata è presente solamente in uno dei due enantiomeri, detto eutomero. L’altro enantiomero, detto distomero, è inattivo o meno attivo. Un esempio è il farmaco antiinfiammatorio ibuprofene, un derivato arilpropionico: solamente l’enantiomero S è dotato di attività farmacologica.

Enantiomeri dell'IbuprofeneI derivati arilpropionici vengono venduti come miscele racemiche perché a livello epatico una racemasi converte il distomero in eutomero.
Tuttavia è anche possibile che il distomero produca effetti dannosi e debba essere eliminato dalla miscela racemica. Un tragico esempio è la talidomide, un sedativo ed anti-nausea commercializzato come miscela racemica dagli anni ‘50 fino al 1961, ed utilizzato anche in gravidanza.

Enantiomeri della TalidomideIl distomero, l’enantiomero S, poteva causare gravi difetti alla nascita, in particolare la focomelia. Questo è forse l’esempio più eclatante dell’importanza delle proprietà chirali delle molecole, che ha poi spinto gli organismi di salute pubblica a promuovere, da parte dell’industria farmaceutica , la sintesi di farmaci, talidomide compresa, contenenti un singolo enantiomero.

Centri di chiralità

Un qualsiasi atomo tetraedrico che leghi quattro ligandi differenti può essere un centro chirale.
L’esempio classico è l’atomo di carbonio, ma anche altri atomi appartenenti al gruppo IVA della tavola periodica, come i semimetalli silicio (Si) ed il germanio (Ge), formano composti a struttura tetraedrica e possono essere centri di chiralità. Anche l’atomo di fosforo negli organofosfati ha una geometria tetraedrica, quindi, quando lega quattro diversi sostituenti, è un centro chirale.
L’atomo di azoto di un’ammina terziaria, un’ammina dove tre gruppi organici differenti sono legati all’azoto, è un centro chirale. In questi composti l’atomo di azoto è disposto al centro di un tetraedro ed i suoi quattro orbitali ibridi sp3 sono diretti verso i vertici, tre dei quali sono occupati dai tre sostituenti, mentre verso il quarto è diretta la coppia di elettroni solitaria.
Inversione dell'azoto e chiralitàA temperatura ambiente, l’azoto inverte rapidamente la sua configurazione. Il fenomeno è noto come inversione dell’azoto, ossia, una rapida oscillazione dell’atomo e dei suoi ligandi, nel corso della quale l’azoto passa attraverso uno stato di transizione planare in cui ha ibridazione sp2. Come conseguenza, se l’atomo di azoto è il solo centro chirale della molecola, non c’è attività ottica in quanto si viene a formare una miscela racemica. L’inversione di configurazione viene evitata solamente in alcuni casi in cui l’azoto fa parte di una struttura ciclica che la impedisce. Dunque, la presenza di un centro chirale può non essere sufficiente per permettere la separazione dei rispettivi enantiomeri.

Nota: nel 1874, Jacobus Henricus van ‘t Hoff e Joseph Achille Le Bel basandosi anche sui risultati ottenuti da Pasteur, per primi ipotizzarono la “teoria dell’atomo di carbonio tetraedrico”. Per questo lavoro van ’t Hoff ricevette il primo premio Nobel per la chimica nel 1901.

Molecole chirali senza centri chirali

La chiralità può essere presente anche in assenza di un centro chirale, ed essere conseguenza della mancanza di libera rotazione attorno ad un legame doppio o singolo, come nel caso dei:

  • derivati allenici, composti organici che presentano due doppi legami cumulati, cioè due doppi legami localizzati sullo stesso atomo di carbonio;
  • derivati bifenilici.

Chiralità conseguente alla presenza di un asse chiraleIn questo caso la chiralità è conseguente alla presenza di un asse chirale.

Composti meso

I composti meso o forme meso sono stereoisomeri che possiedono due o più centri chirali ma sono sovrapponibili alla loro immagine speculare, dunque sono achirali, e come tali otticamente inattivi. Inoltre posseggono un piano di simmetria interno che taglia la molecola in due metà, ognuna immagine speculare dell’altra. I composti meso possono quindi essere classificati come diastereoisomeri, ossia stereoisomeri diversi dagli enantiomeri.
Per una molecola con n centri di chiralità il numero massimo di possibili stereoisomeri è 2n.
Si consideri il 2,3-butandiolo. La molecola presenta due centri di chiralità, i carboni 2 e 3, quindi si potrebbero avere 22 = 4 stereoisomeri, le cui strutture sono riportate in figura, secondo le proiezioni di Fischer, ed indicate come A, B, C, D.
Stereoisomeri, centri di chiralità e mesocompostiLe strutture A e B sono l’una l’immagine speculare dell’altra e non sono sovrapponibili, dunque sono una coppia di enantiomeri.
Le strutture C e D sono l’una l’immagine speculare dell’altra, ma sono sovrapponibili. Se infatti si ruota la struttura C o D di 180°, le due strutture si possono sovrapporre. Quindi non sono enantiomeri: sono la stessa molecola scritta con orientamento differente. Inoltre hanno un piano di simmetria interno che le suddivide in due metà, l’una immagine speculare dell’altra. Dunque, la struttura C (o D) è un composto meso perché ha centri chiarali, è sovrapponibile alla sua immagine speculare e presenta un piano di simmetria interno che divide la molecola in due metà speculari.

Bibliografia

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Isomeria

Il fenomeno per cui due o più composti chimici differenti presentano la stessa formula molecolare è chiamato isomeria, dal greco isos che significa uguale e meros che significa parte, concetto e termine introdotti dallo scienziato svedese Jacob Berzelius nel 1830.
L’isomeria è conseguenza del fatto che gli atomi presenti in una stessa formula molecolare possono unirsi in diversi modi a dare composti, detti isomeri, che posseggono proprietà fisiche e chimiche differenti.
L’isomeria può essere di due tipi: isomeria di struttura e stereoisomeria, a loro volta suddividibili in ulteriori sottotipi.

Schema delle Diverse Tipologie di Isomeria

INDICE

Isomeria di struttura

Nella isomeria di struttura, anche detta strutturale o di costituzione, gli isomeri differiscono tra di loro in quanto gli atomi costituenti sono legati con in modi e sequenze differenti.
Esistono diversi sottotipi di isomeria di struttura: l’isomeria di posizione, di gruppo funzionale e di catena.

Isomeri di posizione

Nella isomeria di posizione o posizionale gli isomeri hanno gli stessi gruppi funzionali ma disposti in posizioni diverse sulla stessa catena carboniosa.
Un esempio è il composto di formula molecolare C6H4Br2, di cui esistono tre isomeri: l’1,2-dibromobenzene, l’1,3-dibromobenzene e l’1,4-dibromobenzene. I tre isomeri differiscono per la posizione degli atomi di bromo sulla struttura ciclica.

Isomeria Posizionale

Un altro esempio è il composto di formula molecolare C3H8O, di cui esistono due isomeri: 1-propanolo o alcol n-propilico, ed il 2-propanolo o alcol isopropilico. Questi isomeri differiscono per la posizione del gruppo ossidrilico lungo la catena carboniosa.

Isomeri di Posizione

Isomeri di gruppo funzionale

Nella isomeria di gruppo funzionale, anche detta isomeria funzionale, gli atomi sono organizzati in modo da dare luogo alla formazione di gruppi funzionali diversi.
Un esempio è il composto di formula molecolare C2H6O, di cui esistono due isomeri: il dimetiletere o etere dimetilico e l’etanolo o etil alcool, che presentano gruppi funzionali diversi, un gruppo etere, –O–, ed un gruppo ossidrilico, –OH.

Isomeria di Gruppo Funzionale

Isomeri di catena

Nella isomeria di catena gli isomeri differiscono nella disposizione delle catene carboniose, che possono essere ramificate o lineari.
Un esempio è il composto di formula molecolare C5H12, di cui esistono tre isomeri: l’n-pentano, il 2-metilbutano o isopentano ed il 2,2-dimetilpropano o neopentano.

Isomeri di Catena

Stereoisomeria

Nella stereoisomeria gli isomeri hanno lo stesso numero e tipo di atomi e legami ma differiscono nella orientazione degli atomi nello spazio. Questi isomeri sono detti stereoisomeri, dal greco stereos che significa “solido”.
La stereoisomeria può essere di due tipi: isomeria conformazionale ed isomeria configurazionale. Quest’ultima è suddividibile in due ulteriori sottotipi, l’isomeria ottica e l’isomeria geometrica.

Isomeria conformazionale

Nella isomeria conformazionale gli stereoisomeri possono essere interconvertiti tra a seguito di rotazioni attorno ad uno o più legami singoli, i legami σ. Queste rotazioni producono disposizioni differenti degli atomi nello spazio che non sono sovrapponibili. Inoltre, il numero delle possibili conformazioni che una molecola può assumere è in teoria infinito, variando dalla struttura a più bassa energia, la più stabile, a quella a più alta energia, la meno stabile. Ciascun isomero è definito conformero.
Se ad esempio si considera l’etano, di formula molecolare C2H4, guardando la molecola da una estremità lungo la direzione del legame carbonio-carbonio, gli atomi di idrogeno di un gruppo metilico possono trovarsi rispetto agli atomi di idrogeno dell’altro gruppo metilico in una delle seguenti conformazioni.

  • In conformazione eclissata, nella quale gli atomi di idrogeno di un gruppo metilico sono nascosti da quelli dell’altro gruppo metilico, quindi l’angolo tra i legami carbonio-idrogeno tra i carboni anteriori e posteriori, detto angolo diedro, può essere 0, 120, 240 o 360 gradi. Questa è la conformazione a più alta energia, dunque la meno stabile.
  • In conformazione sfalsata, nella quale gli atomi di idrogeno di un gruppo metilico sono completamente sfalsati rispetto a quelli dell’altro gruppo metilico, quindi l’angolo diedro può essere 60, 180 o 300 gradi. Questa è la conformazione a più bassa energia, quindi la più stabile.
  • In conformazioni sgembe, che corrispondono ad una qualsiasi delle conformazioni intermedie tra le due precedenti.

Conformeri dell'Etano: Proiezioni di Newman
La maggiore o minore stabilità dei conformeri dipende dal grado di sovrapposizione delle coppie di elettroni dei legami carbonio-idrogeno dei due gruppi metilici:

  • nella conformazione sfalsata la distanza è la massima possibile;
  • nella conformazione eclissata le coppie elettroniche sono alla distanza minima possibile.

La barriera di energia potenziale tra le due conformazioni opposte è piccola, circa 2,8 kcal/mole (11,7 kJ/mole). A temperatura ambiente l’energia cinetica posseduta dalle molecole è di 15-20 kcal/mole (62,7-83,6 kJ/mole), più che sufficiente a permettere la libera rotazione attorno al legame carbonio-carbonio. Di conseguenza non è possibile isolare i singoli conformeri dell’etano.
Nota: considerando il doppio legame carbonio-carbonio, la barriera di energia potenziale che si oppone alla libera rotazione attorno al doppio legame è di circa 63 kcal/mole (264 kJ/mole), e corrisponde all’energia necessaria per rompere il legame π (Vedi isomeria geometrica). Questa quantità di energia è circa tre volte l’energia cinetica posseduta dalle molecole a temperatura ambiente, alla quale quindi la libera rotazione è impedita. Solamente a temperature superiori ai 300° le molecole acquistano un’energia termica sufficiente a rompere il legame π, permettendo così la libera rotazione intorno al legame σ rimanente, e quindi l’interconversione tra gli isomeri cis e trans.

Isomeria configurazionale

Nella isomeria configurazionale l’interconversione tra gli isomeri non avviene a seguito di rotazioni attorno a legami singoli ma comporta la rottura di legami e la formazione di nuovi legami, quindi a temperatura ambiente non avviene spontaneamente.
Esistono due sottotipi di isomeria configurazionale: l’isomeria ottica e l’isomeria geometrica.

Isomeri ottici

L’isomeria ottica è caratteristica delle molecole che hanno uno o più centri chirali o centri di chiralità, ossia un atomo tetraedrico che leghi quattro ligandi differenti. Il centro chirale può essere un atomo di carbonio, fosforo, zolfo o azoto.

Centro Chirale o di Chiralità
Nota: la parola chiralità deriva dal greco cheiros che significa “mano”.
Gli isomeri ottici mancano di un centro di simmetria o di un piano di simmetria, sono immagini speculari gli uni degli altri, e non sono sovrapponibili. Questi stereoisomeri sono detti enantiomeri, dal greco enántios che significa “contrario”.
A differenza degli altri isomeri, due enantiomeri hanno identiche proprietà fisiche e chimiche con due sole eccezioni.

  • La direzione di rotazione del piano della luce polarizzata, da cui il nome di isomeria ottica.
    Se una soluzione di un enantiomero ruota il piano della luce polarizzata in senso orario, l’enantiomero viene indicato con il simbolo (+). Di contro, una soluzione dell’altro enantiomero ruota il piano della luce polarizzata in senso antiorario dello stesso angolo, e l’enantiomero è indicato con il simbolo (-).
  • Sebbene spesso indistinguibili dalla maggior parte delle tecniche, due enantiomeri possono essere distinti in un ambiente chirale, come il sito attivo di enzimi chirali.

Si noti che per una molecola con n centri chirali esiste un numero massimo di stereoisomeri pari a 2n.


Isomeri geometrici

L’isomeria geometrica, anche detta isomeria cis-trans, è caratteristica delle molecole dove non è possibile la libera rotazione tra due atomi per la presenza di strutture rigide come:

  • i composti con doppi legami carbonio-carbonio, carbonio-azoto o azoto-azoto, dove la rigidità è dovuta al doppio legame;
  • i composti ciclici, dove la rigidità è dovuta alla presenza dell’anello.

Un esempio di isomeria geometrica dovuta ad un doppio legame carbonio-carbonio si ha con lo stilbene, composto di formula molecolare C14H12, di cui esistono due isomeri. In uno, definito isomero cis, i gruppi uguali sono dalla stessa parte rispetto al piano individuato dal doppio legame, mentre nell’altro, detto isomero trans, i gruppi uguali sono da parti opposte.

Isomeria GeometricaNota: i termini trans e cis derivano dal latino trans che significa “al di la”, e cis che significa “di qua”.
Tra i composti ciclici, l’isomeria cis-trans non complicata dalla presenza di centri chirali si osserva nei sistemi con numero pari di atomi di carbonio e sostituiti in posizioni opposte, ossia para-sostituiti. Un esempio è l’1,4-dimetilcicloesano, un cicloalcano, idrocarburi ciclici di formula generale CnH2n,, di cui esistono due stereoisomeri, il cis-1,4-dimetilcicloesano ed il trans-1,4-dimetilcicloesano.

Isomeri cis-trans

Questo tipo di stereoisomeria non può esistere nel caso in cui uno dei due atomi non liberi di ruotare leghi due gruppi identici. Perché? Per passare dallo stereoisomero cis a quello trans è necessario scambiare tra di loro i due gruppi legati ad uno dei due atomi impegnati nel doppio legame. Se i due gruppi sono uguali lo scambio porta alla formazione della stessa molecola.

Nota: gli isomeri geometrici sono un caso particolare di diastereomeri o diastereoisomeri, che, a loro volta, sono stereoisomeri che non sono l’uno l’immagine speculare dell’altro. Gli altri diastereomeri sono i composti meso e gli isomeri ottici non enantiomerici.


Bibliografia

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Pressione osmotica

In una soluzione, le molecole di solvente tendono a spostarsi dalla regione dove la loro concentrazione è maggiore verso quella a concentrazione minore. Se si considerano due soluzioni separate da una membrana semipermeabile, ossia una membrana che consenta il passaggio solo a certi ioni o molecole, in questo caso le molecole di solvente, si verrà a creare attraverso la membrana un flusso netto di molecole di solvente dalla soluzione a concentrazione maggiore di solvente verso quella a concentrazione minore. Questo porta allo sviluppo di una pressione detta pressione osmotica, indicata con Π, che può essere definita come la forza che deve essere applicata per impedire lo spostamento delle molecole di solvente attraverso una membrana semipermeabile.
Pressione osmotica: due soluzioni differenti separate da una membrana semipermeabile
Assieme all’innalzamento del punto di ebollizione, all’abbassamento del punto di congelamento e alla tensione di vapore, la pressione osmotica è una delle quattro proprietà colligative delle soluzioni, proprietà che dipendono solo dal numero di particelle di soluto presenti in soluzione, ioni, molecole o strutture sopramolecolari che siano, e non dalla natura delle particelle stesse o dalla loro massa.
Per soluzioni con n soluti, l’equazione che descrive la pressione osmotica è la somma dei contributi di ciascun soluto:

Π = RT(i1c1 + i2c2 + … + incn)

L’equazione è conosciuta come equazione di van ‘t Hoff, dove:

  • T è la temperatura assoluta, che è espressa in Kelvin;
  • R è la costante dei gas, pari a 8,314 J/mole K;
  • c è la concentrazione molare del soluto;
  • i è il fattore di van ‘t Hoff.

INDICE

Fattore di van ‘t Hoff

Il fattore di van ‘t Hoff è una misura del grado di dissociazione del soluto in soluzione, ed è descritto dall’equazione:

i = 1 + α(n-1)

dove:

  • α è il grado di dissociazione delle molecole di soluto, pari al rapporto tra le moli delle molecole di soluto che hanno subito dissociazione e il numero delle moli iniziali, e può assumere valori compresi tra 0, per sostanze che non si ionizzano o dissociano, ed 1, per sostanze che si ionizzano o dissociano completamente in soluzione;
  • n è il numero di ioni ottenuti dalla dissociazione completa della molecola di soluto.

Se si considerano specie non ionizzabili, come il glucosio, il glicogeno o l’amido, n = 1 e i = 1.
Per specie che in soluzione diluite si dissociano completamente, come acidi e basi forti o sali, il fattore di van ‘t Hoff è un numero intero maggiore di uno, essendo α = 1 e n pari ad almeno 2. Se ad esempio si considera il cloruro di sodio, NaCl, il cloruro di potassio, KCl, o il cloruro di calcio, CaCl2, si ha:

NaCl → Na+ + Cl
KCl → K+ + Cl
CaCl2 → Ca2+ + 2 Cl

Quindi nei primi due casi i = 2, mentre con il cloruro di calcio è pari a 3.
Infine, per sostanze che non si ionizzano completamente, come acidi e basi deboli, i non è un numero intero.

Il termine ic, il prodotto del fattore di van ‘t Hoff e la concentrazione molare del soluto, è l’osmolarità della soluzione, ossia la concentrazione delle particelle di soluto osmoticamente attive per litro di soluzione.

Pressione osmotica, osmosi e membrane cellulari

L’osmosi può essere definita come il movimento o flusso netto di un solvente attraverso una membrana semipermeabile, sotto la spinta delle differenze di pressione osmotica tra i due lati della membrana, al fine di cercare di uguagliare la concentrazione del soluto ai due lati della membrana stessa.
Nei sistemi biologici l’acqua è il solvente e le membrane plasmatiche sono le membrane semipermeabili. Le membrane plasmatiche consentono il passaggio alle molecole d’acqua, grazie alla presenza di canali proteici, le acquaporine, nonché a piccole molecole non polari che possono diffondere rapidamente attraverso esse, mentre sono stanzialmente impermeabili a ioni e macromolecole. La presenza all’interno della cellula di macromolecole come acidi nucleici, proteine, glicogeno e aggregati sopramolecolari, ad esempio i complessi multienzimatici, ma anche ioni in concentrazione maggiore rispetto a quella dell’ambiente extracellulare, fa si che la pressione osmotica guidi l’acqua dall’esterno all’interno della cellula. Se questo flusso netto di acqua verso l’interno della cellula non fosse controbilanciato si avrebbe in breve una distensione della membrana plasmatica tale da comportarne la rottura, ossia la cellula scoppierebbe a causa di un eccesso di acqua al suo interno, si verificherebbe cioè una lisi osmotica. In condizioni fisiologiche questo non avviene in quanto nel corso dell’evoluzione si sono sviluppati diversi meccanismi che si oppongono, e in alcuni casi addirittura sfruttano, queste forze osmotiche. Due di questi sono le pompe ioniche energia dipendenti e, nei batteri, nei fungi e nelle cellule vegetali, la parete cellulare.

Pompe ioniche energia dipendenti

Le pompe ioniche riducono, con spesa di ATP, le concentrazioni intracellulari di determinati ioni rispetto alle loro concentrazioni nell’ambiente extracellulare, creando quindi una ineguale distribuzione degli ioni stessi sui due lati della membrana plasmatica, ossia creando un gradiente ionico. In questo modo la cellula controbilancia le forze osmotiche dovute agli ioni e macromolecole intrappolate al suo interno. Un esempio di pompa ionica energia dipendente è la Na+/K+ ATPasi, che riduce la concentrazione intracellulare di Na+ rispetto all’esterno della cellula.

Parete cellulare

Le cellule vegetali sono circondate da una matrice extracellulare, la parete cellulare, che, essendo non espandibile e posizionata in prossimità della membrana plasmatica, permette alla cellula di resistere alle forze osmotiche che potrebbero causarne il rigonfiamento e infine la lisi. In che modo? Nelle cellule vegetali mature i vacuoli sono gli organelli di dimensioni maggiori, arrivando ad occupare circa l’80% del volume cellulare. Al loro interno vengono accumulate grandi quantità di soluti, per la maggior parte acidi organici ed inorganici, i quali osmoticamente richiamano acqua, il che determina il rigonfiamento del vacuolo stesso. A sua volta questo fa si che il tonoplasto, la membrana che circonda l’organello, spinga la membrana plasmatica contro la parete cellulare, la quale, opponendosi meccanicamente a queste forze, permette di evitare la lisi osmotica. Questa pressione osmotica è chiamata pressione di turgore e può raggiungere le 20 atmosfere, 2 MPa, un valore circa 10 volte maggiore rispetto alla pressione dei pneumatici. La pressione di turgore è responsabile della rigidità delle parti non legnose delle piante, è coinvolta nella crescita della pianta, nonchè:

  • nell’avvizzimento della verdura, a seguito di una sua riduzione;
  • nei movimenti delle piante, quali:
    • i movimenti circadiani delle foglie;
    • i movimenti delle foglie della Dionaea muscipula, una pianta carnivora, o delle foglie delle Mimosa pudica.

Anche nei batteri e funghi la membrana plasmatica è circondata da una parete cellulare sufficientemente rigida e non espandibile da impedire la lisi osmotica della cellula.

Soluzioni isotoniche, ipotoniche ed ipertoniche

Dal confronto tra la pressione osmotica di sue soluzioni separate da una membrana semipermeabile è possibile definire tre tipi di soluzioni, di seguito brevemente descritte.

  • Due soluzioni che abbiano la stessa pressione osmotica sono definite isotoniche.
  • Se due soluzioni hanno differenti pressione osmotica, quella a pressione maggiore viene definita ipertonica rispetto all’altra.
  • Se due soluzioni hanno differenti pressioni osmotiche, quella a pressione minore viene definita ipotonica rispetto all’altra.

Nei sistemi biologici la soluzione di riferimento è rappresentata dal citosol; quindi, ponendo una cellula in una soluzione:

  • isotonica, non si avrà trasferimento netto di acqua tra l’interno e l’esterno della cellula stessa;
  • ipertonica, sia avrà un trasferimento netto di acqua dalla cellula verso l’esterno, la cellula perde acqua e si raggrinzisce;
  • ipotonica, si verifica un trasferimento netto di acqua al suo interno, la cellula si rigonfia e può arrivare a scoppiare, ossia si può verificare una lisi osmotica.

In aggiunta alle pompe ioniche e alla parete cellulare, nel corso dell’evoluzione gli organismi pluricellulari hanno sviluppato un’altra soluzione per opporsi alle forze osmotiche: circondare le cellule con soluzioni isotoniche o prossime all’isotonicità che impediscano o comunque limitino un influsso o un efflusso netto di acqua. Un esempio è il plasma, ossia il sangue privato della componente cellulare, che, grazie alla presenza di sali e proteine, nell’uomo principalmente l’albumina, ha un’osmolarità simile a quella presente nel citosol.

Pressione osmotica, amido e glicogeno

Gli organismi immagazzinano glucosio non in forma libera ma come polimeri, glicogeno gli animali, i funghi ed i batteri, amido le piante, in questo modo evitando che la pressione osmotica esercitata dalle riserve glucidiche diventi troppo grande. Infatti, dato che la pressione osmotica, al pari delle altre proprietà colligative, dipende solo dal numero delle molecole di soluto, immagazzinare milioni di molecole di glucosio in forma di un numero notevolmente inferiore di polisaccaridi permette di evitarne un aumento abnorme. Di seguito alcuni esempi.

  • Se si considera un polisaccaride, come il glicogeno o amido, formato da 1000 unità di glucosio e del peso di un grammo, questi ha un effetto sulla pressione osmotica inferiore a quello di un milligrammo di glucosio libero.
  • Considerando un epatocita, se il glucosio immagazzinato in forma di glicogeno fosse presente come glucosio libero, la sua concentrazione sarebbe di circa 0,4 M, contro una concentrazione del glicogeno di circa 0,04 μM. Questo causerebbe un flusso netto di acqua verso l’interno della cellula tale da portare a lisi osmotica.
    Inoltre, se anche si riuscisse ad evitare la lisi osmotica, si avrebbero problemi riguardo al trasporto del glucosio all’interno della cellula. Nell’uomo, in condizioni fisiologiche, la concentrazione ematica del glucosio è compresa nell’intervallo 3,33-5,56 mmol/L o 60-100 mg/dL; se il glucosio fosse immagazzinato in forma libera la sua concentrazione intracellulare sarebbe da 120 a 72 volte maggiore di quella sanguigna, e il suo trasporto nell’epatocita comporterebbe un grande dispendio energetico.

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Enzimi multifunzionali

Gli enzimi multifunzionali sono proteine in cui due o più siti attivi che catalizzano reazioni consecutive di una via metabolica sono presenti in una catena polipeptidica. Sembra probabile che derivino da eventi di fusione genica rappresentando, al pari dei complessi multienzimatici, una soluzione adottata dall’evoluzione per massimizzare l’efficienza catalitica, assicurando vantaggi che non si avrebbero nel caso in cui le singole attività enzimatiche fossero presenti su proteine distinte e libere.

INDICE

Quali vantaggi offrono gli enzimi multifunzionali?

Gli organismi viventi combattono con l’inevitabile processo di decadimento che, se non contrastato, conduce ad un crescente aumento del disordine, sino alla morte. A livello molecolare il mantenimento della vita è reso possibile dalla grande efficienza raggiunta dagli enzimi nell’accelerare le reazioni chimiche e nell’evitare reazioni collaterali. Un’idea della velocità con cui procede il metabolismo cellulare è fornita dalla velocità del turn over dell’ATP in una cellula di mammifero: ogni 1-2 minuti l’intero pool del trifosfato è idrolizzato e risintetizzato. Tradotto in numeri questo corrisponde al turn over di circa 107 molecole di ATP al secondo, e, per il corpo umano, a circa 1 grammo di ATP al minuto. Alcuni enzimi hanno addirittura raggiunto la perfezione catalitica, ossia sono talmente efficienti che quasi ogni collisione con il proprio substrato porta alla catalisi.
Enzimi multifunzionaliE uno dei fattori limitanti la velocità di una reazione enzimatica è la proprio frequenza con cui enzimi e substrati collidono. Il modo più semplice per aumentare la frequenza delle collisioni sarebbe quello di aumentare la concentrazione di substrati ed enzimi. Tuttavia, dato l’elevatissimo numero di differenti reazioni che avvengono all’interno della cellula, questa strada non è praticabile. Esiste cioè un limite alle concentrazioni che substrati ed enzimi possono raggiungere, concentrazioni che sono dell’ordine delle micromoli per i substrati, e anche più basse per gli enzimi. Fanno eccezione gli enzimi della glicolisi nelle cellule muscolari e negli eritrociti, presenti in concentrazioni dell’ordine delle 0.1 mM e anche maggiori.
Una delle strade percorse dall’evoluzione per aumentare la velocità con cui procedono le reazioni enzimatiche è stata quella di selezionare strutture molecolari, quali gli enzimi multifunzionali ed i complessi multienzimatici, che permettano, attraverso l’ottimizzazione dell’organizzazione spaziale degli enzimi di una via metabolica, di minimizzare la distanza che il prodotto della reazione A deve percorrere per raggiungere il sito attivo che catalizza la reazione successiva B, e così via, ottenendo cioè l’incanalamento dei substrati della via stessa. Per alcuni enzimi multifunzionali e complessi multienzimatici l’incanalamento è ottenuto grazie alla presenza di veri e propri tunnel intramolecolari. L’incanalamento dei substrati migliora l’efficienza catalitica, e quindi la velocità di reazione, in vari modi, di seguito brevemente descritti.

  • Minimizza la diffusione nel mezzo circostante del reagente, quindi la sua diluizione, permettendo così di raggiungere concentrazioni locali elevate, anche quando la sua concentrazione nella cellula è bassa, aumentando quindi la frequenza delle collisioni enzima-substrato.
  • Riduce il tempo di transito dei substrati da un sito attivo al successivo.
  • Minimizza la probabilità che si verifichino reazioni collaterali.
  • Minimizza la probabilità che intermedi chimicamente labili siano degradati.

Gli enzimi multifunzionali offrono vantaggi anche dal punto di vista della regolazione della loro sintesi, essendo possibile coordinare la sintesi di tutte le attività enzimatiche interessate grazie al fatto che la struttura è codificata da un singolo gene.

Infine, analogamente ai complessi multienzimatici, è possibile regolare in modo coordinato le attività enzimatiche presenti. Se a questo si aggiunge che spesso l’enzima che catalizza la tappa di comando della sequenza è quello che catalizza la prima reazione, è possibile sia evitare la sintesi di molecole non necessarie, che sarebbero invece prodotte se la tappa di comando fosse a valle della prima reazione, come pure uno spreco di energia e la sottrazione di metaboliti ad altre vie metaboliche.

Esempi di enzimi multifunzionali

Al pari dei complessi multienzimatici, anche gli enzimi multifunzionali sono molto comuni e coinvolti in vie metaboliche sia anaboliche che cataboliche.
Di seguito alcuni esempi.

Acetil-CoA carbossilasi

L’acetil-CoA carbossilasi o ACC (EC 6.4.1.2), una carbossilasi biotina-dipendente, è formata da due enzimi, la biotina carbossilasi (EC 6.3.4.14) e una transcarbossilasi, più la proteina trasportatrice della biotina o BCCP, acronimo dell’inglese biotin carboxyl-carrier protein. ACC catalizza la sintesi del malonil-CoA via carbossilazione dell’acetil-CoA. La reazione, che rappresenta la tappa di comando della sintesi degli acidi grassi, procede in due tappe. Nella prima la biotina carbossilasi catalizza il trasferimento di una molecola di anidride carbonica (CO2) dallo ione bicarbonato ad un atomo di azoto dell’anello della biotina, che funge da trasportatore temporaneo di CO2. La reazione comporta il consumo di una molecola di ATP. Nella seconda tappa la transcarbossilasi catalizza il trasferimento del gruppo carbossilico dalla carbossi-biotina all’acetil-CoA a dare malonil-CoA. Il malonil-CoA verrà di seguito utilizzato come donatore di unità bicarboniose dalla acido grasso sintasi (EC 2.3.1.85) durante l’allungamento degli acidi grassi.
Nei mammiferi e negli uccelli l’acetil-CoA carbossilasi è un enzima multifunzionale essendo le due attività enzimatiche, e BCCP, presenti su un’unica catena polipeptidica. Nei batteri invece ACC è un complesso multienzimatico formato dall’aggregazione di tre catene polipeptidiche, ossia i due enzimi più BCCP.
Nelle piante superiori sono presenti entrambe le forme.

Acido grasso sintasi di tipo I

L’acido grasso sintasi o FAS, acronimo dell’inglese fatty acid synthase, catalizza la sintesi dell’acido palmitico utilizzando il malonil-CoA, che è il prodotto della reazione catalizzata dalla acetil-CoA carbossilasi, come donatore di unità bicarboniose.
Esistono due tipi di acido grasso sintasi.
Negli animali e nei funghi è un enzima multifunzionale, ed è detto di tipo I. Negli animali è un omodimero, ed in ogni catena polipeptidica sono presenti le sette le attività enzimatiche e la proteina trasportatrice di acili o ACP, acronimo dell’inglese acyl carrier protein. Nei lieviti e nei funghi FAS è formata da due subunità multifunzionali, dette α and β, disposte a formare una struttura eterododecamerica α6β6.
Nella maggior parte dei procarioti e nelle piante l’acido grasso sintasi, detta di tipo II, non è un enzima multifunzionale ma un complesso multienzimatico essendo composto da enzimi distinti più  ACP.

PRA isomerasi:IGP sintasi

La sintesi dell’aminoacido triptofano a partire dal corismato coinvolge diversi passaggi, di seguito brevemente descritti.
Nel primo, la glutammina dona un atomo di azoto all’anello indolico del corismato, che è convertito in antranilato, e la glutammina in glutammato; la reazione è catalizzata dalla antranilato sintasi (EC 4.1.3.27). L’antranilato è fosforibosilato a spese del 5-fosforibosil-1-pirofosfato o PRPP, acronimo dell’inglese 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate, a dare N-(5’-fosforibosil)-antranilato o PRA, acronimo dell’inglese N-(5′-phosphoribosyl)-anthranilate, nella reazione catalizzata dalla antranilato fosforibosiltransferasi (EC 2.4.2.18). Nel passaggio successivo, catalizzato dalla PRA isomerasi (EC 5.3.1.24), PRA è isomerizzato a dare enol-1-o-carbossifenilamino-1-desossiribulosio fosfato o CdRP, acronimo dell’inglese enol-1-o-carboxyphenylamino-1-desoxyribulose phosphate. CdRP, è convertito in indolo-3-glicerolo fosfato o IGP, acronimo dell’inglese indole-3-glycerol phosphate, nella reazione catalizzata dalla indolo-3-glicerofosfato sintasi o IGP sintasi (EC 4.1.1.48). Infine, la triptofano sintasi (EC 4.2.1.20) catalizza gli ultimi due passaggi della via: la conversione di IGP in indolo, una idrolisi, e la reazione dell’indolo con una serina a dare il triptofano.
In E. coli, PRA isomerasi e IGP sintasi sono presenti su un’unica catena polipeptidica, che è quindi un enzima bifunzionale. In altri microorganismi, come Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium e Pseudomonas putida le due attività enzimatiche sono presenti su catene polipeptidiche distinte.
La triptofano sintasi è invece un esempio di complesso multienzimatico, ed uno degli esempi meglio caratterizzati di canalizzazione del flusso dei metaboliti.

Glutammina-PRPP amido transferasi

La glutammina-PRPP ammidotransferasi (EC 2.4.2.14) catalizza la prima della 10 tappe che portano alla sintesi de novo delle purine, ossia la formazione della 5-fosforibosilammina a seguito del trasferimento dell’azoto ammidico della glutammina, che funge quindi da fonte di azoto, al PRPP.
La reazione procede in due tappe, catalizzate nei due siti attivi dell’enzima, un sito N-terminale ed uno C-terminale. Nella prima tappa, il sito attivo N-terminale catalizza l’idrolisi dell’azoto ammidico della glutammina a dare ammoniaca e glutammato. Nella seconda tappa, catalizzata dal sito attivo C-terminale, che ha attività fosforibosiltransferasica, l’ammoniaca precedentemente rilasciata viene legata al C-1 del PRPP a dare la 5-fosforibosilammina. In questa reazione si verifica l’inversione della configurazione del C-1 del ribosio, da α a β, stabilendo la forma anomerica del nucleotide in via di sintesi.
Ci sono tre punti di controllo che cooperano nella regolazione della sintesi de novo dei nucleotidi purinici, e la reazione catalizzata dalla glutammina-PRPP ammidotransferasi, che è anche la prima reazione esclusiva della via, è il primo.
Al pari del complesso della carbamil fosfato sintetasi batterica, anche i siti attivi di questo enzima multifunzionale sono connessi attraverso un canale intramolecolare. Tuttavia questo canale è più corto, essendo lungo circa 20 Å, ed è delimitato da residui amminoacidici non polari, quindi è altamente idrofobico. Mancando gruppi in grado di stabilire legami idrogeno, il tunnel permette la diffusione dell’ammoniaca verso il secondo sito attivo.

CAD

La sintesi de novo dei nucleotidi pirimidinici avviene attraverso una serie di reazioni enzimatiche che, a differenza di quanto accade nella sintesi de novo dei nucleotidi purinici, comporta dapprima la formazione dell’anello pirimidinico e quindi il suo legame al ribosio-5-fosfato. Le prime tre tappe della via sono catalizzate in sequenza dalla carbamil fosfato sintetasi (EC 6.3.4.16), aspartato transcarbamilasi (EC 2.1.3.2) e diidroorotasi (EC 3.5.2.3), e sono comuni a tutte le specie.
Nella prima tappa, la carbamil fosfato sintetasi, che presenta due attività enzimatiche, ossia una attività amidotransferasica glutammina dipendente ed un’attività sintasica, catalizza la sintesi del carbamil fosfato a partire da glutammina, ione bicarbonato ed ATP. Nella seconda tappa, che è quella di comando della via metabolica ed è catalizzata dalla aspartato transcarbamilasi, il carbamil fosfato reagisce con l’aspartato a dare l’N-carbamil aspartato. Infine la diidroorotasi, catalizzando la rimozione di una molecola d’acqua dall’N-carbamil aspartato, porta alla chiusura dell’anello pirimidinico a formare L-diidroorotato.
Negli eucarioti, in particolare nei mammiferi, in Drosofila e Dictyostelium, un genere di amebe, le tre attività sono presenti su una singola catena polipeptidica, codificata da un singolo gene derivante da una fusione avvenuta almeno 100 milioni di anni fa. L’enzima multifunzionale, abbreviato come CAD, è un omomultimero composto da tre subunità o più.
Nei procarioti invece i tre enzimi sono indipendenti, e la carbamil fosfato sintetasi è un esempio di complesso multienzimatico.
Nei lieviti l’attività diidroorotasica è presente su una proteina separata.
Studi sull’attività enzimatica hanno rivelato l’esistenza di un incanalamento dei substrati, più efficace nella proteina del lievito, riguardo ai primi due passaggi, rispetto a quella dei mammiferi.

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Complessi multienzimatici

I complessi multienzimatici sono strutture discrete e stabili formate da enzimi associati in modo non covalente che catalizzano due o più reazioni consecutive di una via metabolica.
Possono essere considerati come un passo in avanti nell’evoluzione dell’efficienza catalitica in quanto assicurano vantaggi che i singoli enzimi, anche quelli che hanno raggiunto la perfezione catalitica, da soli non avrebbero.

INDICE

Quali vantaggi offrono i complessi multienzimatici?

Nel corso dell’evoluzione alcuni enzimi si sono evoluti sino al raggiungimento della perfezione catalitica. Si tratta cioè di enzimi per i quali quasi ogni collisione con il proprio substrato ne determina la conversione in prodotto. Esempi sono:

  • la fumarasi (EC 4.2.1.2), che catalizza la settima tappa del ciclo dell’acido citrico, ossia l’idratazione/deidratazione reversibile del doppio legame del fumarato a dare malato;
  • l’acetilcolinesterasi (EC 3.1.1.7), che catalizza l’idrolisi dell’acetilcolina, un neurotrasmettitore, in colina e acido acetico, che a sua volta si dissocia a dare acetato e ioni idrogeno;
  • la superossido dismutasi (EC 1.15.1.1), che catalizza la conversione, e quindi l’inattivazione, del radicale superossido (O2.-), una specie molto reattiva, in perossido d’idrogeno od acqua ossigenata (H2O2) ed acqua;
  • la catalasi (EC 1.11.1.6), che catalizza la degradazione di H2O2 in acqua ed ossigeno.

La velocità con cui avviene una reazione enzimatica è dunque in parte è determinata dalla frequenza con cui i substrati e gli enzimi stessi collidono. Ne deriva che un modo semplice per aumentarla sia quello di aumentare le concentrazioni di enzima e substrato. Tuttavia, visto l’enorme numero di reazioni che si verificano all’interno della cellula le loro concentrazioni non potranno essere elevate. Ed infatti nella cellule la concentrazione della maggior parte dei metaboliti è dell’ordine delle micromoli (10-6 M), e per la maggior parte degli enzimi anche più bassa.
L’evoluzione ha quindi imboccato strade differenti per aumentare la velocità di reazione, una delle quali è stata quella di ottimizzare l’organizzazione spaziale degli enzimi con la formazione dei complessi multienzimatici e degli enzimi multifunzionali, ossia strutture che permettono di minimizzare la distanza che il prodotto di una reazione deve percorrere per passare al sito attivo che catalizza la reazione successiva, essendo i siti attivi vicini gli uni agli altri. Si verifica cioè l’incanalamento dei substrati, in inglese substrate o metabolic channeling, incanalamento che può avvenire anche attraverso veri e propri canali intramolecolari che connettono i siti attivi, come nel caso, tra i complessi enzimatici, del complesso della triptofano sintasi (EC 4.2.1.20), il cui tunnel fu il primo ad essere scoperto, e quello della carbamil fosfato sintetasi batterica (EC 6.3.4.16).
L’incanalamento dei substrati è in grado di aumentare la velocità di reazione, ma più in generale l’efficienza catalitica, in più modi, di seguito brevemente descritti.

  • Viene limitata al minimo la diffusione di substrati e prodotti nel mezzo circostante, quindi la loro diluizione e riduzione della concentrazione, producendo anzi elevate concentrazioni locali anche quando la loro concentrazione cellulare è bassa, il che porta ad un aumento della frequenza delle collisioni enzima-substrato.
  • Viene ridotto il tempo di transito dei substrati da un sito attivo al sito attivo successivo.
  • Viene ridotta la probabilità che si verifichino reazioni collaterali.
  • Gli intermedi chimicamente labili sono protetti dalla degradazione da parte del solvente.

Un altro vantaggio metabolico apportato dai complessi multienzimatici, analogamente a quanto accade con gli enzimi multifunzionali, è che consentono di controllare in modo coordinato l’attività catalitica degli enzimi che lo compongono. E se si aggiunge il fatto che spesso l’enzima che catalizza la prima reazione della sequenza è l’enzima regolatorio, è possibile evitare:

  • la sintesi di intermedi non necessari, altrimenti prodotti se la sequenza di reazioni fosse regolata a valle della prima reazione;
  • la sottrazione di metaboliti ad altre vie come pure uno spreco di energia.

Esempi di complessi multienzimatici

Da quanto detto in precedenza non sorprende che, specialmente nelle cellule eucariote, i complessi multienzimatici, al pari degli enzimi multifunzionali, siamo comuni e coinvolti in differenti vie metaboliche, sia anaboliche che cataboliche, mentre sono pochi gli enzimi liberamente diffusibili. Di seguito alcuni esempi.

Alfa-chetoacido deidrogenasi

Esempi classici di complessi multienzimatici sono i tre complessi appartenenti alla famiglia delle alfa-chetoacido deidrogenasi o 2-ossiacido deidrogenasi, ossia:

  • il complesso della piruvato deidrogenasi o PDC, acronimo dell’inglese pyruvate dehydrogenase complex;
  • il complesso dell’α-chetoacido deidrogenasi a catena ramificata o BCKDH , acronimo dell’inglese branched-chain α-keto acid dehydrogenase complex;
  • il complesso della α-chetoglutarato deidrogenasi, o 2-oxoglutarato deidrogenasi o OGDH, acronimo dell’inglese 2-oxoglutarate dehydrogenase.

I tre complessi sono correlati sia dal punto di vista strutturale che funzionale.
Considerando ad esempio il complesso della piruvato deidrogenasi questi è formato da copie multiple di tre enzimi differenti:

PDC, sia nei procarioti che negli eucarioti presenta quindi una struttura di base E1-E2-E3, struttura che si ritrova anche negli altri due complessi. In aggiunta, all’interno di una data specie:

E, sebbene questi enzimi siamo specifici per i rispettivi substrati,  utilizzano gli stessi cofattori, ossia il coenzima A, il NAD, al tiamina pirofosfato, il FAD e la lipoamide.
Al fine di differenziarle vengono indicate, per il complesso della piruvato deidrogenasi, della α-chetoglutarato deidrogenasi e della α-chetoacido deidrogenasi a catena ramificata, rispettivamente come:

  • E1p, E1o ed E1b (EC 1.2.4.4);
  • E3p, E3o, and E3b (EC 1.8.1.4).

Nota: il complesso della piruvato deidrogenasi degli eucarioti è il più grande complesso multienzimatico conosciuto, più grande di un ribosoma e visibile anche al microscopio elettronico.

Il complesso della piruvato deidrogenasi, che rappresenta il ponte di collegamento tra glicolisi e ciclo dell’acido citrico, catalizza la decarbossilazione ossidativa del piruvato, un α-chetoacido. Nel corso delle reazioni il gruppo carbossilico del piruvato viene rilasciato in forma di anidride carbonica (CO2) e si verifica il trasferimento del gruppo acetilico risultante al coenzima A a dare acetil-coenzima A. Inoltre sono rilasciati due elettroni che sono trasferiti al NAD+.

Complessi Multienzimatici
Fig. 1 – Le Cinque Reazioni Catalizzate da PDC

Anche nel corso delle reazioni catalizzate dal complesso della α-chetoglutarato deidrogenasi e dal complesso della α-chetoacido deidrogenasi a catena ramificata, rispettivamente quarta reazione del ciclo dell’acido citrico, ossia l’ossidazione dell’α-chetoglutarato a succinil-CoA, e l’ossidazione degli α-chetoacidi derivanti dal catabolismo degli amminoacidi a catena ramificata valina, leucina ed isoleucina, si verifica:

  • la liberazione del carbonio carbossilico dell’alfa-chetoacido in forma di CO2;
  • il trasferimento del gruppo acilico risultante al coenzima A a dare l’acil-CoA corrispondente;
  • la riduzione del NAD+ a NADH.

Dunque, la notevole somiglianza esistente tra le strutture proteiche, i cofattori richiesti ed i meccanismi di reazione riflettono senza dubbio una origine evolutiva comune.

Che cosa sono i chetoacidi?

I chetoacidi o ossiacidi sono composti organici contenenti due gruppi funzionali: un gruppo carbossilico ed uno chetonico. In base alla posizione del gruppo chetonico si possono individuare alfa-chetoacidi, beta-chetoacidi e gamma-chetoacidi.

  • Negli alfa-chetoacidi o 2-ossiacidi il gruppo chetonico è in posizione α (2) rispetto al carbonio carbossilico, ossia adiacente ad esso. Questi composti sono particolarmente importanti in biologia in quanto coinvolti nella glicolisi, l’acido piruvico, il più semplice degli α-chetoacidi, e nel ciclo dell’acido citrico, l’acido ossalacetico e l’acido α-chetoglutarico.
  • Nei beta-chetoacidi o 3-ossiacidi il gruppo chetonico è in posizione β (3) rispetto al carbonio carbossilico. Un esempio è l’acido acetoacetico, il più semplice tra i β-chetoacidi, e uno dei tre corpi chetonici, assieme all’acetone e l’acido β-idrossibutirrico, prodotti dall’epatocita nel caso in cui ci sia un eccesso di acetil-CoA, come durante il digiuno o diete povere di carboidrati.
  • Nei gamma-chetoacidi o 4-ossiacidi il gruppo chetonico è in posizione γ (4) rispetto al carbonio carbossilico. Un esempio è l’acido levulinico, il più semplice dei γ-chetoacidi, derivante dal catabolismo della cellulosa.
Chetoacidi
Fig. 2 – Chetoacidi

Triptofano sintasi

Il complesso della triptofano sintasi è uno degli esempi di incanalamento dei substrati meglio studiati. Presente nei batteri e nelle piante ma non negli animali, nei batteri è formato da due subunità α e due β assemblate in unità dimeriche αβ, che sembrano esser l’unità funzionale del complesso, a dare una struttura tetramerica αββα.
Il complesso catalizza gli ultimi due passaggi della sintesi del triptofano: dall’indolo-3-glicero fosfato, per azione di una liasi (EC 4.1.2.8) presente sulle subunità α, viene liberata una molecola di gliceraldeide-3-fosfato e l’indolo. L’indolo diffonde quindi verso il sito attivo presente sulla subunità β sfruttando un tunnel idrofobico di circa 30 Å che, in ciascuna coppia αβ, connette i due siti attivi. Nel sito attivo della subunità β avviene, in presenza del piridossal-5-fosfato, la condensazione tra l’indolo ed una serina a dare il triptofano.

Acetil-CoA carbossilasi

L’acetil-CoA carbossilasi o ACC (EC 6.4.1.2), membro della famiglia delle carbossilasi biotina-dipendenti, catalizza la prima tappa di comando della sintesi degli acidi grassi, ossia la carbossilazione dell’acetil-CoA a malonil-CoA, che è utilizzato come donatore di unità bicarboniose dalla acido grasso sintasi (EC 2.3.1.85) durante il processo di allungamento che porterà alla sintesi dell’acido palmitico.
Nei batteri ACC è un complesso multienzimatico composto da due enzimi, la biotina carbossilasi (EC 6.3.4.14) e una carbossitransferasi, cui si aggiunge una proteina trasportatrice della biotina o BCCP, acronimo dell’inglese biotin carboxyl-carrier protein.
Nei mammiferi e negli uccelli è invece un enzima multifunzionale, in quanto le due attività enzimatiche sono presenti su una stessa catena polipeptidica, nella quale si ritrova anche BCCP.
Nelle piante superiori sono presenti entrambe le forme.

Carbamil fosfato sintetasi

Altro esempio ben caratterizzato di incanalamento dei substrati è il complesso della carbamil fosfato sintetasi dei batteri, che catalizza la sintesi del carbamil fosfato, necessario sia per la sintesi delle pirimidine che per quella dell’arginina. Il complesso presenta un tunnel lungo circa 100 Å all’interno del quale si muovono i prodotti delle sue tre attività enzimatiche.
La prima catalizza la cessione dell’azoto ammidico della glutammina in forma di ione ammonio, il quale entra nel tunnel dove nel secondo sito attivo si combina con il bicarbonato, a spese di una molecola di ATP, a dare carbamato, che infine nell’ultimo sito attivo viene fosforilato a carbamil fosfato.

Bibliografia

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Complesso della piruvato deidrogenasi

Il complesso della piruvato deidrogenasi o PDC, acronimo dell’inglese pyruvate dehydrogenase complex, è un complesso multienzimatico mitocondriale composto da tre differenti enzimi:

  • piruvato deidrogenasi o E1 (EC 1.2.4.1);
  • diidrolipoil transacetilasi o E2 (EC 2.3.1.12);
  • diidrolipoil deidrogenasi o E3 (EC 1.8.1.4).

Ognuno di questi enzimi è presente in più copie il cui numero, e quindi le dimensioni del complesso stesso, varia da specie a specie, con una massa molecolare che oscilla da 4 a 10 milioni di Dalton.

Fanno parte del complesso multienzimatico anche:

  • cinque differenti coenzimi;
  • nelle piante, nei funghi e, tra gli animali, nei volatili e nei mammiferi, due enzimi con attività regolatoria: la piruvato deidrogenasi chinasi (EC 2.7.1.99), enzima Mg2+-dipendente, e la piruvato deidrogenasi fosfatasi) (EC 3.1.3.43), enzima attivato dagli ioni calcio (Ca2+);
  • negli eucarioti, una proteina con funzione di legame, E3BP.

Il complesso della piruvato deidrogenasi catalizza, attraverso una sequenza di cinque reazioni, la decarbossilazione ossidativa del piruvato, un α-chetoacido, a dare il gruppo il gruppo acetilico dell’acetil-coenzima A o acetil-CoA, una molecola di CO2, e due elettroni trasportati dal NAD. La stechiometria complessiva della sequenza delle cinque reazioni è:

Complesso della Piruvato Deidrogenasi
Fig. 1 – PDC: Reazione Complessiva

La reazione complessiva è essenzialmente irreversibile, con un ΔG°’ pari a -8,0 kcal/mol (-33,4 kJ/mol), e richiede l’intervento sequenziale di tutti e tre gli enzimi, le cui attività risultano coordinate. Nel corso delle reazioni i prodotti intermedi rimangono legati agli enzimi e al termine della sequenza catalitica il complesso multienzimatico è pronto per il ciclo successivo.

Complesso della Piruvato Deidrogenasi
Fig. 2 – Le Cinque Reazioni Catalizzate da PDC

Nota: il complesso della piruvato deidrogenasi catalizza le stesse reazioni attraverso meccanismi simili in tutti gli organismi in cui è presente.

INDICE

I coenzimi del complesso della piruvato deidrogenasi

Cinque coenzimi partecipano alle reazioni catalizzate dal complesso della piruvato deidrogenasi: la tiamina pirofosfato o TPP, acronimo dell’inglese thiamine pyrophosphate, la flavina adenina dinucleotide o FAD, il coenzima A o CoA, la nicotinammide adenina dinucleotide o NAD, e l’acido lipoico.

  • La tiamina pirofosfato deriva dalla tiamina o vitamina B1 di cui rappresenta la forma biologicamente attiva.
    Tiamina Pirofosfato
    Fig. 3 – TPP

    TPP è il coenzima della piruvato deidrogenasi cui è strettamente, ma non covalentemente, legata. Il suo ruolo è quello di trasportatore di gruppi idrossietilici o “aldeidici attivati”.

  • La flavina adenina dinucleotide deriva dalla riboflavina o vitamina B2, di cui rappresenta una delle forme attive; l’altra è la flavina mononucleotide o FMN.
    Flavina Adenina Dinucleotide
    Fig. 4 – FAD

    Il FAD è il coenzima della diidrolipoil deidrogenasi cui è saldamente legato. Il suo ruolo, analogamente al NAD, è quello di trasportatore di elettroni o ioni idruro (:H o H+ + 2e).

  • Il coenzima A è formato da una β-mercaptoetilamina legata attraverso legame ammidico all’acido pantotenico o vitamina B5, che a sua volta è unito, attraverso un ponte pirofosfato, ad una 3’-fosfoadenosina.
    Il CoA partecipa alla reazione catalizzata dalla diidrolipoil transacetilasi. Il suo ruolo è quello di trasportatore di gruppi acilici.

    Coenzima A
    Fig. 5 – Coenzima A

    La porzione del coenzima A corrispondente alla β-mercaptoetilamina termina con un gruppo sulfidrilico (–SH), un tiolo reattivo cruciale per il ruolo svolto dal coenzima in quanto i gruppi acilici trasportati, legati attraverso un legame tioestere, hanno una elevata energia libera standard di idrolisi. Ciò fornisce loro un elevato potenziale di trasferimento, pari a -31,5 kcal/mol (-7,5 kJ/mol), che risulta addirittura più esoergonico, anche se di solo 0,2 kcal/mol (1 kJ/mol), rispetto a quello per l’idrolisi dell’ATP ad ADP e Pi. Pertanto i tioesteri hanno un elevato potenziale di trasferimento del gruppo acilico e sono in grado di donarlo a numerose molecole accettrici. In altre parole il gruppo acilico legato al coenzima A può essere considerato come una forma attivata pronta per il trasferimento. E’ anche possibile affermare che la formazione del legame tioestere permette di conservare parte dell’energia metabolica derivante dall’ossidazione del carburante metabolico. E va sottolineato che il coenzima A è anche abbreviato come CoA-SH, proprio per enfatizzare il ruolo svolto dal gruppo tiolico.
    Nota: nel legame tioestere è presente un atomo di zolfo nella posizione in cui nel legame estere è presente un atomo di ossigeno.

    Legami Tioestere ed Estere
    Fig. 6 – Legami Estere e Tioestere
  • La nicotinammide adenina dinucleotide può essere prodotta a partire dal triptofano, un aminoacido essenziale, o dalla niacina o vitamina B3 o vitamina PP, da Pellagra-Preventing, la fonte della parte nicotinammidica.
    Nicotinammide Adenina Dinucleotide
    Fig. 7 – NAD

    Il NAD è coinvolto nella reazione catalizzata dalla diidrolipoil deidrogenasi. Il suo ruolo, analogamente al FAD, è quello di trasportatore di elettroni, o ioni idruro.

  • A differenza degli altri coenzimi del complesso della piruvato deidrogenasi, l’acido lipoico non deriva, direttamente o indirettamente, da vitamine e/o aminoacidi essenziali, ossia da precursori che non possono essere sintetizzati de novo dall’organismo e devono essere assunti con la dieta.
    L’acido lipoico è il coenzima della diidrolipoil transacetilasi, cui è covalentemente legato, attraverso legame ammidico, all’ε-ammino gruppo di un suo residuo di lisina a formare un residuo di lipoil-lisina o lipoammide. Il coenzima accoppia il trasferimento di elettroni con quello di gruppi acilici.

    Complesso della Piruvato Deidrogenasi
    Fig. 8 – Lipoil-lisina

    L’acido lipoico possiede due gruppi tiolici che possono andare incontro ad ossidazione intramolecolare reversibile a dare un ponte disolfuro (-S-S-), similmente a quanto può accadere tra due residui di cisteina (Cys) di una proteina.
    Poiché il ponte disolfuro (nota: un disolfuro ciclico) può andare incontro a reazioni di ossidoriduzione, nel corso delle reazioni catalizzate dal complesso è dapprima ridotto a diidrolipoammide, un ditiolo o la forma ridotta del gruppo prostetico, e quindi riossidato nel disolfuro ciclico.

Nota
Molti enzimi necessitano per la loro attività catalitica di piccoli componenti non proteici chiamati cofattori. I cofattori possono essere ioni metallici o piccole molecole organiche o metallo-organiche e sono classificati come coenzimi e gruppi prostetici.
Un gruppo prostetico è un cofattore che si lega saldamente a un enzima con un legame non covalente o covalente, vale a dire che è legato in modo permanente alla proteina.
Un coenzima è un cofattore che non è legato in modo permanente all’enzima.

Localizzazione del complesso della piruvato deidrogenasi

Negli eucarioti il complesso della piruvato deidrogenasi, al pari degli enzimi del ciclo dell’acido citrico e di quelli per l’ossidazione degli acidi grassi, si trova nel mitocondrio, associato alla superficie della membrana mitocondriale interna che guarda la matrice.
Nei procarioti si trova nel citosol.

Funzioni del complesso della piruvato deidrogenasi

Il complesso della piruvato deidrogenasi ha essenzialmente due funzioni: produrre acetil-CoA e NADH.

Acetil-CoA
Fig. 9- Acetil-CoA
  • Il gruppo acetilico legato al coenzima A, un acetato attivato, a seconda delle condizioni metaboliche della cellula e/o del tipo di cellula, potrà essere:

ossidato a due molecole di anidride carbonica attraverso le reazioni del ciclo dell’acido citrico, il che permette la “raccolta” di una parte dell’energia potenziale immagazzinata in forma di ATP o GTP;
utilizzato per la sintesi di acidi grassi, colesterolo, steroidi, isoprenoidi, corpi chetonici e acetilcolina.

E’ quindi possibile affermare che, a seconda delle condizioni metaboliche e/o del tipo di cellula, il complesso della piruvato deidrogenasi indirizza intermedi carboniosi dal catabolismo degli aminoacidi e del glucosio verso:

il ciclo dell’acido citrico, e quindi la produzione di energia, come ad esempio nel muscolo scheletrico in condizioni aerobiche, e, sempre, nel muscolo cardiaco;
la sintesi dei lipidi e di acetilcolina.

  • Negli organismi aerobi il NADH potrà essere ossidato a NAD+ a seguito della cessione di uno ione idruro alla catena di trasporto degli elettroni mitocondriale che, a sua volta, trasferisce i due elettroni all’ossigeno molecolare (O2), trasferimento che permette la produzione di 2,5 molecole di ATP per coppia di elettroni.
    Complesso della Piruvato Deidrogenasi
    Fig. 10 – Anello Nicotinammidico: Forma Ridotta

    Nota: negli organismi anaerobi è presente un accettore di elettroni alternativo all’ossigeno, come ad esempio un nitrato o un solfato.

Dal punto di vista concettuale il complesso della piruvato deidrogenasi rappresenta il ponte di collegamento tra glicolisi e ciclo dell’acido citrico. Tuttavia, vista l’irreversibilità della reazione complessiva catalizzata dal complesso, questo ponte è “a senso unico”: il piruvato può essere decarbossilato, ossidato e l’unità acetilica rimanente legata al CoA, ma non è possibile compiere il percorso inverso, ossia convertire acetil-CoA in piruvato.
L’irreversibilità di questa reazione e l’assenza di vie metaboliche alternative spiega perché non è possibile utilizzare l’acetil-CoA, e quindi gli acidi grassi, per la gluconeogenesi (vedi sotto).

Altre fonti di acetil-CoA

Il gruppo acetilico dell’acetil-CoA può derivare, oltre che dal piruvato, dall’ossidazione degli acidi grassi e dal catabolismo di molti aminoacidi. Tuttavia, a prescindere dalla sua origine, l’acetil-CoA rappresenta un veicolo di ingresso di nuove unità carboniose nel ciclo dell’acido citrico. E’ anche possibile affermare che il gruppo acetilico dell’acetil-CoA rappresenta la forma in cui la maggior parte del carbonio entra nel ciclo.

Fonti di piruvato

Il piruvato può derivare da diverse fonti citosoliche.

  • In condizioni fisiologiche nella maggior parte delle cellule deriva principalmente dalla glicolisi: dall’ossidazione di una molecola di glucosio se ne vengono a formare due di piruvato.
  • Il lattato, nella reazione catalizzata dalla lattico deidrogenasi (EC 1.1.1.27), può essere ossidato a piruvato. Infatti, gli isoenzimi in cui predomina la subunità H, come LDH1 o H4, un omopolimero di subunità H presente nel muscolo cardiaco, un tessuto completamente aerobico, catalizzano preferenzialmente l’ossidazione del lattato.
    L’ossidazione del lattato può avvenire anche negli epatociti, nel corso della gluconeogenesi, favorita dal basso rapporto NADH/NAD+ nel citosol. Si noti comunque che il lattato è un metabolita derivante dal catabolismo del glucosio, e quindi dei carboidrati.
  • Altra fonte importante è rappresentata dal malato, nella reazione catalizzata dall’enzima malico citosolico (EC 1.1.1.40), enzima che svolge un ruolo importante nel trasporto di intermedi del ciclo dell’acido citrico, quali ossalacetato, malato e citrato, tra il citosol e la matrice mitocondriale.

Malato + NADP+ → Piruvato + CO2 + NADPH + H+

  • Infine, anche gli scheletri carboniosi di sei aminoacidi, ossia alanina, cisteina, glicina, serina, treonina e triptofano, possono essere convertiti in toto o in parte in piruvato.

A sua volta il piruvato è un intermedio metabolico che può essere utilizzato in numerose vie metaboliche, sia anaboliche che cataboliche, quali la gluconeogenesi, la sintesi dei lipidi, e il metabolismo ossidativo. Inoltre, può avere anche una funzione anaplerotica, avendo un ruolo nel mantenimento del flusso di metaboliti attraverso il ciclo dell’acido citrico.

Trasporto del piruvato nella matrice mitocondriale

Negli eucarioti, la glicolisi avviene nel citosol mentre tutti i passaggi successivi del metabolismo aerobico, quindi le reazioni catalizzate dal complesso della piruvato deidrogenasi, il ciclo dell’acido citrico, la catena di trasporto degli elettroni e la fosforilazione ossidativa, si svolgono nel mitocondrio.
Similmente a quanto accade per la maggior parte degli altri anioni e metaboliti, il passaggio del piruvato attraverso la membrana mitocondriale esterna è probabilmente mediato da un canale anionico voltaggio-dipendente relativamente non specifico. Il passaggio attraverso la membrana mitocondriale interna è invece assicurato da uno specifico trasportatore formato da due proteine denominate MPC1 e MPC2, acronimo dell’inglese mitochondrial pyruvate carrier, che vanno a formare un complesso etero-oligomerico nella membrana.

Struttura del complesso della piruvato deidrogenasi

Sebbene il complesso della piruvato deidrogenasi sia formato da copie multiple di tre enzimi differenti e catalizzi le medesime reazioni tramite meccanismi simili in tutti gli organismi in cui è presente, ha una struttura quaternaria molto varia.
Il primo complesso di cui fu analizzata la struttura fu quello di E. coli, grazie al lavoro di Lester Reed. Nel complesso multienzimatico, che ha un peso di circa 4600 kD ed un diametro di circa 300 Å, 24 unità di diidrolipoil transacetilasi vanno a formare una struttura con simmetria cubica, ossia, gli enzimi, associati in trimeri, sono disposti agli angoli del cubo. Dimeri di piruvato deidrogenasi si associano al nucleo di diidrolipoil transacetilasi, al centro di ognuno dei 12 bordi del cubo, per un totale 24 unità. Infine, dimeri di diidrolipoil deidrogenasi si vanno a disporre al centro di ognuna delle sei facce del cubo, per un totale di 12 unità. Si noti che l’intero complesso è costituito da 60 unità. Anche nella maggior parte degli altri batteri Gram-negativi si osserva una analoga struttura con simmetria cubica.
In alcuni batteri Gram-positivi e negli eucarioti il complesso della piruvato deidrogenasi presenta una struttura dodecaedrica, ossia quella di un poliedro regolare con 20 vertici, 12 facce pentagonali e 30 bordi, con simmetrica icosaedrica, anche detta simmetria I. Se si considera ad esempio il complesso presente nei mitocondri, questi è il più grande complesso multienzimatico conosciuto, con un peso di circa 1000 kD ed un diametro di circa 500 Å, dunque ben 5 volte le dimensioni di un intero ribosoma, e abbastanza grande da poter essere visualizzabile con il microscopio elettronico. Il complesso è costituito da un nucleo dodecaedrico avente un diametro di circa 25 nm e formato, come nei batteri Gram-negativi, dalla diidrolipoil transacetilasi, ma composto da 20 trimeri dell’enzima, per un totale di 60 unità, disposti ai vertici della struttura. Il nucleo è circondato da 30 unità di piruvato deidrogenasi, una centrata su ogni bordo, e 12 unità di diidrolipoil deidrogenasi, una centrata su ogni faccia. L’intero complesso è quindi costituito da 102 unità.

La struttura quaternaria del complesso è ulteriormente complicata, come menzionato in precedenza, dalla presenza di tre subunità addizionali: la piruvato deidrogenasi chinasi, la piruvato deidrogenasi fosfatasi, e la E3BP.
La chinasi e la fosfatasi sono legate al nucleo di diidrolipoil transacetilasi.
E3BP è legata ad ognuna della 12 facce pentagonali, e dunque presente in circa dodici copie. La proteina è necessaria il legame della diidrolipoil deidrogenasi al nucleo formato dalla diidrolipoil transacetilasi, come dimostrato dal fatto che la sua proteolisi parziale riduce la capacità di legame della deidrogenasi. Nella E3-bindign protein è possibile individuare un dominio C-terminale, privo di attività catalitica, ed un dominio che contiene una lipoil-lisina, simile a quella della diidrolipoil transacetilasi, in grado anche di accettare un gruppo acetilico. Tuttavia, la rimozione di questo dominio non comporta alcuna riduzione dell’attività catalitica del complesso multienzimatico.

Struttura della piruvato deidrogenasi o E1

La piruvato deidrogenasi degli eucarioti e di alcuni batteri Gram-positivi è composta da due differenti catene polipeptide, indicate come α e β, disposte a formare un eterotetramero α2β2 simmetrico. Di contro in E. coli e in altri batteri Gram-negativi le subunità sono fuse a formare un’unica catena polipeptidica e l’enzima risulta un omodimero.
L’enzima presenta due siti attivi.
Considerando la struttura eterotetramerica della piruvato deidrogenasi di Bacillus stearothermophilus, un batterio Gram-positivo, ogni tiamina pirofosfato si lega tra i domini N-terminali di una subunità α e di una β, al termine di un canale a forma di imbuto profondo circa 21 Å che porta al sito attivo, con l’anello tiazolico (vedi fig. 3), il suo gruppo reattivo, posizionato vicino all’ingresso del canale stesso. All’ingresso del canale sono inoltre presenti due anse peptidiche conservate, essenziali sia per l’attività catalitica dell’enzima che per la sua regolazione. L’analisi ai raggi X dell’enzima di B. stearothermophilus, quando lega sia la tiamina pirofosfato che PSBD della diidrolipoil transacetilasi, che si lega al dominio C-terminale delle subunità β, ha evidenziato, oltre ad un eterotetramero con un struttura estremamente compatta, che i due siti attivi hanno una struttura differente, in particolare riguardo alla disposizione delle due anse peptidiche conservate. Infatti, in una subunità dell’enzima, in presenza della forma attivata della tiamina pirofosfato, l’ansa più interna è disposta in modo da bloccare l’ingresso al sito attivo, mentre l’ansa all’ingresso dell’altro sito attivo ha una conformazione tale da non bloccarne l’ingresso. Questo spiega dal punto di vista strutturale le differenze osservate nella velocità di legame del substrato esibite dai due siti attivi. Una disposizione ed una asimmetria simili sono state osservate anche in tutti gli altri enzimi tiamina pirofosfato dipendenti di cui sia nota la struttura.
Oltre alla tiamina pirofosfato e ad uno ione magnesio (Mg2+), localizzati in ciascuno dei due siti attivi dell’enzima, un terzo Mg2+ è posizionato al centro del tetramero, all’interno di un tunnel lungo circa 20 Å, riempito di solvente, che collega i due siti attivi. Il tunnel è in gran parte delimitato da 10 residui amminoacidici conservati, rispettivamente sei residui di glutammato (Glu) e quattro di aspartato (Asp), che provengono da tutte e quattro le subunità, più altri residui acidi attorno all’anello amminopirimidinico della TPP. Va invece sottolineata l’assenza di residui basici che neutralizzino i precedenti. Tunnel simili sono stati osservati in tutti gli enzimi tiamina pirofosfato dipendenti con struttura dimerica o tetramerica di cui sia nota la struttura cristallina, ad esempio nella transchetolasi, enzima della via del pentoso fosfato.

Nota: Bacillus stearothermophilus è un membro del phylum Firmicutes ed è stato da poco rinominato Geobacillus stearothermophilus.

Qual’è la funzione del tunnel acido?

Attraverso esperimenti di mutagenesi condotti sulla piruvato deidrogenasi di B. stearothermophilus è stato dimostrato che il tunnel ha un ruolo nel meccanismo catalitico.
La sostituzione di alcuni dei suddetti residui acidi con amminoacidi neutri non alterava, rispetto alla forma wild-type:

Tuttavia, la velocità di decarbossilazione risultava ridotta di oltre il 70% rispetto all’enzima wild-type, come pure, una volta che l’enzima mutante era inserito nel complesso della piruvato deidrogenasi, l’attività del complesso stesso di oltre l’85%, sempre in confronto alla forma wild-type. Ma a che cosa sono dovute queste riduzioni dell’efficienza catalitica?
Poiché la distanza tra gli amminoacidi sostituiti ed i siti attivi dell’enzima è di 7 o più Å, questi amminoacidi sono troppo lontani dai siti attivi per poterne influenzare direttamente l’attività catalitica. E’ stato quindi proposto il meccanismo di seguito descritto.
Considerando l’apoenzima, la tiamina pirofosfato si lega velocemente e fortemente al primo sito attivo, viene attivata, ed il sito attivo viene chiuso, proteggendo così lo zwitterione tiazolico dall’ambiente esterno.
Nel secondo sito attivo invece la tiamina pirofosfato si lega, ma non viene attivata, e quindi il sito attivo rimane in conformazione aperta.
Nel primo sito attivo il piruvato reagisce con il C-2 tiazolico e la tiamina pirofosfato del secondo sito attivo, che è un acido generale, dona un protone al primo sito. Il risultato è una reazione di decarbossilazione nel primo sito attivo e l’attivazione del coenzima nel secondo sito, che quindi viene chiuso.
Si noti che mentre l’attivazione della prima tiamina pirofosfato è conseguente al legame al sito attivo, l’attivazione della seconda, e quindi del secondo sito attivo, è accoppiata alla decarbossilazione del piruvato nel primo sito attivo. O, da un altro punto di vista, mentre un sito attivo richiede un acido generale, l’altro richiede una base generale.
I protoni sono necessari per l’attività catalitica, ed il loro trasferimento tra i siti attivi avviene attraverso il tunnel acido. Si verifica cioè il loro trasporto reversibile lungo una catena di gruppi accettori-donatori forniti dai residui di glutammato ed aspartato e dalle molecole d’acqua presenti nel tunnel, che nell’insieme agiscono come un vero e proprio filo protonico, in inglese proton wire.
Sembra quindi che, a differenza di quanto accade in molti altri enzimi, in cui la comunicazione tra i siti attivi avviene attraverso modificazioni conformazionali e riarrangiamenti delle subunità che costituiscono l’enzima stesso, nella piruvato deidrogenasi e negli altri enzimi tiamina pirofosfato dipendenti il “proton wire” sia la base molecolare di tale comunicazione.
A questo punto l’oloenzima è formato ed i siti attivi si trovano in un equilibrio dinamico, passando vicendevolmente dallo stato dormiente a quello attivato. Questo sembra essere lo stato in cui si trova l’enzima in vivo all’inizio di ogni ciclo catalitico.
Una conseguenza di un tale meccanismo è che, a mano a mano che i cicli catalitici si susseguono, i due siti attivi sono fuori fase tra di loro, ossia mentre uno richiede una base generale, l’altro necessita di un acido generale, e vice versa.
Da notare infine che un tale meccanismo permette anche il cambio di conformazione delle anse che chiudono i siti attivi, in modo da:

  • coordinare l’uptake dei substrati ed il rilascio dei prodotti:
  • spiegare l’asimmetria esistente tra i due siti attivi.

Nota: un apoenzima è un enzima privo dei suoi cofattori, mentre un oloenzima è un enzima che lega tutti i suoi cofattori. L’apoenzima è la forma cataliticamente inattiva dell’enzima, mentre l’oloenzima ne è la forma cataliticamente attiva.

Struttura della diidrolipoil transacetilasi o E2

Nella struttura della diidrolipoil transacetilasi è possibile individuare tre domini funzionalmente distinti: un dominio lipoilico N-terminale, un dominio centrale di legame o PSBD, acronimo dell’inglese peripheral subunit-binding domain, ed un dominio catalitico C-terminale o acetiltransferasico. Questi domini sono connessi da sequenze di circa 20-40 residui amminoacidici ricche in alanina e prolina, aminoacidi idrofobici che sono inframezzati da residui dotati di carica. Queste sequenze di collegamento sono altamente flessibili ed estese, il che permette di tenere lontani gli uni dagli altri i tre domini.

Complesso della Piruvato Deidrogenasi
Fig. 11 – Domini di E2

Nota: analoghe sequenze di collegamento flessibili sono presenti anche in E3BP.

  • Il dominio lipoilico N-terminale, composto da circa 80 residui amminoacidici, è così chiamato in quanto lega l’acido lipoico. Il numero di questi domini dipende dalla specie considerata, variando da uno a tre. Ad esempio è presente con una copia in B. stearothermophilus e nei lieviti, con due nello Streptococcus faecalis e nei mammiferi, e con tre in Azotobacter vinelandii ed E. coli.
    Il legame tra l’ɛ-amino gruppo della catena laterale di una lisina e l’acido lipoico porta alla formazione di un braccio flessibile, la lipoil-lisina o lipoammide, che alla sua massima estensione ha una lunghezza di circa 14 Å. Se a questo si aggiunge la sequenza che collega il dominio N-terminale al dominio adiacente, la cui lunghezza è superiore ai 140 Å, si ottiene un braccio flessibile in grado di far oscillare il gruppo lipoilico tra i siti attivi della piruvato deidrogenasi e della diidrolipoil deidrogenasi, nonché di interagire con le unità di diidrolipoil transacetilasi vicine.
    Si noti che il numero di queste braccia flessibili in E. coli è pari a 3 x 24 = 72, mentre nei mammiferi a 2 x 60 = 120, sulla base del numero dei domini N-terminali e delle unità di diidrolipoil transacetilasi.
    Da tutto ciò consegue che una piruvato deidrogenasi può acetilare numerose diidrolipoil transacetilasi, e una diidrolipoil deidrogenasi può riossidare diversi gruppi diidrolipoamidici.
    Inoltre, si verifica anche:

un interscambio di gruppi acetilici tra i gruppi lipoilici del nucleo di diidrolipoil transacetilasi;
lo scambio sia di gruppi acetilici che di disolfuri tra le braccia flessibili sopracitate.

  • Il dominio catalitico C-terminale, che, ovviamente, contiene il sito attivo, è composto da circa 250 residui amminoacidici disposti a formare una struttura simile ad una gabbia vuota che contiene canali sufficientemente larghi da permettere ai substrati e prodotti di diffondere fuori e dentro. Ad esempio, la lipoamide ed il coenzima A, i due substrati della diidrolipoil transacetilasi, si legano in conformazione estesa alle estremità opposte di un canale che si trova localizzato all’interfaccia tra ogni paio di subunità di ciascun trimero.

Struttura della diidrolipoil deidrogenasi o E3

La struttura della diidrolipoil deidrogenasi è stata desunta dalla studio dell’enzima in numerosi microrganismi. Presenta una struttura omodimerica, con ciascuna catena polipeptidica, formata da circa 470 residui amminoacidici, ripiegata a dare quattro domini, dall’estremità N-terminale a quella C-terminale: un dominio legante il FAD, uno legante il NAD, un dominio centrale, ed un dominio di interfaccia. Tutti prendono parte alla formazione del sito attivo.
Il FAD si trova quasi completamente all’interno della proteina in quanto, a differenza del NADH o dei tioli, è facilmente ossidabile e quindi deve essere protetto dalla soluzione circostante, ossia dall’ossidazione ad opera di O2. E infatti, in assenza del NAD+, la catena laterale fenolica di uno specifico residuo di tirosina (Tyr), ad esempio nel batterio Gram-negativo Pseudomonas putida la Tyr181, va a coprire la tasca dove si va a legare la nicotinamide proteggendo il FADH2 dal contatto con la soluzione.

Complesso della Piruvato Deidrogenasi
Fig. 12 -FADH2

Quando invece il NAD+ è in posizione nel sito attivo, la catena laterale fenolica della suddetta tirosina si va a disporre tra l’anello nicotinamidico e quello flavinico.
Nel sito attivo della forma ossidata dell’enzima è presente anche un ponte disolfuro redox-attivo che si forma tra due residui di cisteina presenti in un segmento della catena polipeptidica altamente conservato, ad esempio in P. putida tra la Cys43 e la Cys48. Il disolfuro è localizzato dal lato dell’anello flavinico opposto rispetto a quello che guarda l’anello nicotinammidico, e lega due giri consecutivi di un segmento di un’α-elica distorta. Da notare che in assenza della distorsione dell’ α-elica i Cα delle due cisteine sarebbero troppo distanti per poter permettere la formazione del ponte disolfuro.
La diidrolipoil deidrogenasi possiede quindi due accettori di elettroni: il FAD e il ponte disolfuro redox-attivo.
Nota: i due anelli eterociclici del NAD e del FAD sono paralleli ed in contatto attraverso interazioni di van der Waals; anche S48 è in contatto di van der Waals con l’anello flavinico, dal lato opposto rispetto all’anello nicotinamidico.

Reazione della piruvato deidrogenasi o E1

La piruvato deidrogenasi, nella sequenza delle cinque reazioni catalizzate dai componenti del complesso della piruvato deidrogenasi, ne catalizza le prime due, ovvero:

  • la decarbossilazione del piruvato a dare CO2 e l’intermedio idrossietil-TPP;
  • l’acetilazione riduttiva del gruppo lipoilico della diidrolipoil transacetilasi.

La prima reazione è essenzialmente identica alla reazione catalizzata dalla piruvato decarbossilasi (EC 4.1.1.1), che opera una decarbossilazione non ossidativa nel corso della fermentazione del glucosio ad etanolo. Quello che differisce è il destino del gruppo idrossietilico legato alla tiamina pirofosfato che, nella reazione catalizzata dalla piruvato deidrogenasi viene trasferito all’enzima successivo della sequenza, la diidrolipoil transacetilasi, mentre nella reazione catalizzata dalla piruvato decarbossilasi è convertito in acetaldeide.

Meccanismo di reazione della piruvato deidrogenasi o E1

Nelle reazioni catalizzate da enzimi TPP-dipendenti, l’anello tiazolico rappresenta la parte attiva, ma solo in forma di carbanione dipolare o ilide, ossia uno ione dipolare o zwitterione, con carica positiva sull’N-3 e carica negativa sul C-2. Di contro, l’anello tiazolico con carica positiva, ossia una carica positiva sull’azoto e nessuna carica sul C-2, può essere definito come la forma “dormiente” o inattiva.
La reazione ha inizio con l’attacco nucleofilo da parte del carbanione sul C-2 al carbonio carbonilico del piruvato, che ha lo stato di ossidazione di un’aldeide. L’attacco porta alla formazione di un legame covalente tra il coenzima e il piruvato.
Segue la scissione del legame tra il C-1 ed il C-2 del piruvato. Questo porta al distacco del gruppo carbossilico, ossia del C-1, in forma di CO2, mentre i due restanti atomi di carbonio, il C-2 ed il C-3, rimangono legati alla tiamina pirofosfato in forma di gruppo idrossietilico. La scissione del legame C-1–C-2, e quindi la decarbossilazione del piruvato, è favorita dal fatto che la carica negativa sul C-2, che è instabile, viene stabilizzata grazie alla presenza nell’anello tiazolico dell’azoto imminico carico positivamente, N-3, (C=N+), ossia grazie alla presenza di una struttura elettrofila o elettron deficiente che funge da “pozzo” o “trappola” per gli elettroni, nella quale gli elettroni del carbanione possono delocalizzarsi per risonanza.
A questo punto l’intermedio stabilizzato per risonanza può essere protonato a dare idrossietil-TPP.
Nota: questo primo passaggio della reazione catalizzata dalla piruvato deidrogenasi è quello dove il complesso della privato deidrogenasi esercita la sua specificità di substrato ed è anche il più lento dell’intera sequenza, ossia è quello che limita la velocità della reazione complessiva.

Complesso della Piruvato Deidrogenasi
Fig. 13 – E1: Meccanismo di Reazione

Di seguito, l’enzima catalizza l’ossidazione del gruppo idrossietilico a gruppo acetilico ed il suo trasferimento sul braccio lipoamidico della diidrolipoil transacetilasi. La reazione ha inizio con la formazione di un carbanione sul carbonio idrossilico della idrossietil-TPP, a seguito della rimozione del protone legato al carbonio stesso da parte di una base dell’enzima. Segue l’attacco nucleofilo del carbanione al disolfuro della lipoamide, con formazione di un legame acetil-tioestere ad alta energia con uno dei due tioli. In questa reazione l’ ossidazione del gruppo idrossietilico a gruppo acetilico è accompagnata dalla concomitante riduzione del ponte disolfuro della lipoamide: i due elettroni rimossi dal gruppo idrossietilico sono utilizzati per ridurre il ponte disolfuro. Questa reazione è quindi una acetilazione riduttiva, cui si accoppia la rigenerazione della forma attiva della piruvato deidrogenasi, ossia l’enzima con il C-2 dell’anello tiazolico nella forma deprotonata, la forma ilide o carbanione dipolare.
Si noti che l’energia derivante dall’ossidazione del gruppo idrossietilico a gruppo acetilico permette la formazione del legame tioestere tra il gruppo acetilico ed il coenzima A.

Nota: come detto in precedenza, il braccio di lipoil-lisina, presente in conformazione estesa nel canale dove si trova anche la TPP, permette il trasferimento dell’idrossietile dalla idrossietil-TPP al coenzima A, ossia braccio di lipoil-lisina si può spostare dal sito attivo della piruvato deidrogenasi a quelli della diidrolipoil transacetilasi e quindi della diidrolipoil deidrogenasi;.

Proprietà della tiamina pirofosfato

Nella molecola della tiamina pirofosfato è possibile individuare tre parti distinte, da cui dipendono le sue proprietà chimiche ed enzimologiche: l’anello tiazolico, l’anello 4’-amminopirimidinico, e il gruppo difosfato (vedi fig. 3).
Il difosfato lega il cofattore all’enzima attraverso la formazione di legami elettrostatici tra le cariche negative portate dai suoi gruppi fosforici e quelle positive degli ioni Ca2+ ed Mg2+ che, a loro volta, sono legati a sequenze altamente conservate, rispettivamente: GlyAspGly (GDG) e GlyAspGly-X26-AsnAsn (GDG-X26-NN).
L’anello tiazolico ha un ruolo centrale nella catalisi grazie alla capacità di formare un carbanione, ossia un centro nucleofilo sul C-2.
Nota: come accennato in precedenza, una volta legatasi all’enzima, la tiamina pirofosfato si dispone nel sito attivo in modo che l’anello tiazolico sia posizionato vicino all’ingresso del canale che porta al sito attivo stesso.
L’anello amminopirimidinico ha una duplice funzione:

  • ancora il coenzima tenendolo in posizione;
  • ha uno specifico ruolo catalitico, partecipando ad una catalisi acido/base, come evidenziato da studi condotti utilizzando analoghi della tiamina pirofosfato in cui, a turno, erano stati sostituiti i tre atomi di azoto dell’anello. Questi studi hanno dimostrato che l’atomo N-1’ ed il gruppo amminico legato ad N-4’ sono necessari per l’attività del coenzima, mentre l’atomo N-3’ lo è meno.

Come si forma il carbanione dipolare della tiamina pirofosfato?

E’ possibile individuare tre forme tautomeriche in cui si presenta l’anello amminopirimidinico della tiamina pirofosfato legata allo specifico enzima ancora non impegnato nella reazione:

  • la forma canonica, ossia la 4’-amminopirimidina;
  • la forma protonata su N-1’, ossia lo ione 4’-amminopirimidinio;
  • l’1’,4’-imminopirimidina.

E sembra che la 1’,4’-imminopirimidina sia il tautomero che, prima dell’arrivo del substrato nel sito attivo, subisce la deprotonazione. Il C-2 dell’anello tiazolico è, come spiegato anche nell’articolo sulla via del pentoso fosfato, assai più acido rispetto alla maggior parte degli altri gruppi =C-H presenti in altre molecole. La maggior acidità, ossia il fatto che il protone legato al C-2 sia facilmente dissociabile, è dovuta alla presenza dell’atomo di azoto quaternario con carica positiva dell’anello tiazolico che è in grado di stabilizzare elettrostaticamente il carbanione risultante. Nel processo di deprotonazione sembra avere un ruolo essenziale il gruppo amminico dell’anello amminopirimidinico: il gruppo funge da base ed è posizionato opportunamente per accettare il protone. Tuttavia, nella forma canonica, la 4’-amminopirimidina, uno dei suoi protoni collide stericamente con il protone legato al C-2; in aggiunta anche il suo pK è troppo basso per operare la deprotonazione in modo efficiente. E’ stato quindi proposto un meccanismo in cui la catena laterale di un residuo conservato di glutammato, ad esempio βGlu59 in B. stearothermophilus, o Glu51 nella piruvato decarbossilasi di Saccharomyces uvarum (lievito di birra), donando un protone all’amminopirimidina la converte nella sua forma immino tautomerica, la 1’,4’-imminopirimidina, che, accettando il protone dal C-2, torna alla forma canonica 4’-amminopirimidinica e permette la formazione del carbanione.

Nota: la formazione del carbanione sul C-2 è quindi conseguenza di un trasferimento protonico intramolecolare.

Deprotonazione della tiamina pirofosfato e chiusura del sito attivo

La perdita del protone dal C-2 dell’anello tiazolico porta, da una situazione con carica positiva sull’anello, alla formazione di uno ione dipolare o zwitterione. Questo cambio nello stato di carica innesca una modificazione conformazionale in una delle due anse peptidiche conservate presenti all’ingresso del canale che immette al sito attivo, nello specifico la più interna, modificazione che, a sua volta, porta alla chiusura dello canale rispetto all’ambiente acquoso circostante. In questa conformazione chiusa il carbanione tiazolico è protetto dall’attacco di reagenti vari, come elettrofili.
Riassumendo, la deprotonazione della tiamina pirofosfato determina la chiusura del sito attivo e la protezione del carbanione dipolare neoformato; in altri termini, gli enzimi TPP-dipendenti sarebbero attivi solo nella conformazione chiusa.
Se invece si considera l’altro sito attivo, la sua tiamina pirofosfato non è in forma di ilide, il è canale aperto, ed il sito stesso risulta inattivo.

Reazione della diidrolipoil transacetilasi o E2

La diidrolipoil transacetilasi catalizza la terza reazione della sequenza delle cinque catalizzate dai componenti del complesso della piruvato deidrogenasi, ossia il trasferimento del gruppo acetilico dall’acetil-diidrolipoammide al coenzima A, a dare acetil-CoA e la forma completamente ridotta della lipoammide, la diidrolipoammide, il ditiolo.
Va notato che il gruppo acetilico, inizialmente legato tramite legame estere ad uno dei gruppi –SH della lipoammide è di seguito legato al gruppo –SH del coenzima A, di nuovo attraverso legame estere, da cui il termine di transesterificazione.

Meccanismo di reazione della diidrolipoil transacetilasi o E2

Nel corso della reazione, il gruppo sulfidrilico del coenzima A porta un attacco nucleofilo al carbonio carbonilico del gruppo acetilico dell’acetil diidrolipoammide-diidrolipoil transacetilasi a formare un intermedio tetraedrico transiente che si “decompone” a dare acetil-CoA e diidrolipoammide-diidrolipoil transacetilasi.

Complesso della Piruvato Deidrogenasi
Fig. 14 – E2: Meccanismo di Reazione

Come già detto, nel meccanismo di reazione gioca un ruolo centrale la mobilità della lipoammide.

Reazione della diidrolipoil deidrogenasi o E3

La diidrolipoil deidrogenasi catalizza la quarta e la quinta reazione della sequenza delle cinque catalizzate dai componenti del complesso della piruvato deidrogenasi.
L’enzima catalizza trasferimenti di elettroni necessari per rigenerare il ponte disolfuro della lipoammide della diidrolipoil transacetilasi, ossia per rigenerare la forma ossidata del gruppo prostetico e completare così il ciclo catalitico della transacetilasi.
La reazione segue un meccanismo a ping-pong, procedendo attraverso due semireazioni consecutive nelle quali i due substrati, la diidrolipoammide ed il NAD+, reagiscono uno in assenza dell’altro. Inoltre durante la prima semireazione, il rilascio del primo prodotto e la formazione di un complesso enzima-intermedio si verificano prima che il secondo substrato si leghi, mentre l’enzima va incontro ad un cambio strutturale, mentre nella seconda semireazione si verificano il rilascio del secondo prodotto ed il ritorno dell’enzima allo stato iniziale, di nuovo attraverso una modificazione strutturale.
Considerando la cinetica del meccanismo a ping-pong della diidrolipoil deidrogenasi:

  • nella prima semireazione si verifica l’ossidazione della diidrolipoamide a lipoammide;
  • nella seconda semireazione si verifica la riduzione del NAD+ a NADH.

Meccanismo di reazione della diidrolipoil deidrogenasi o E3

Di seguito viene descritto il meccanismo di reazione della diidrolipoil deidrogenasi di P. putida.
Nella prima semireazione l’enzima in forma ossidata (E), ossia con il ponte disolfuro tra la Cys43 e la Cys48, lega la diidrolipoammide (LH2) a formare il complesso enzima-diidrolipoammide (E●LH2). A questo punto un atomo di zolfo della diidrolipoammide porta un attacco nucleofilo allo zolfo della Cys43, con formazione di un ponte disolfuro lipoammide-Cys43, (E–S–S–L), mentre lo zolfo della Cys48 viene rilasciato in forma di ione tiolato (S48).
Il protone che è rimasto sul secondo gruppo tiolico della lipoammide è quindi estratto ad opera dell’istidina (Hys) 451, che agisce come catalizzatore acido-base generale, il che porta alla formazione di un secondo ione tiolato, stavolta sulla lipoamide (E–S–S–L●S), il quale, attraverso un attacco nucleofilo, va a sostituire lo zolfo della Cys43, S43, aiutato in questo attacco dalla catalisi acida generale ad opera della Hys451 che dona un protone ad S43. L’azione catalitica della Hys451 è essenziale, come dimostrato da studi di mutagenesi in cui la sua sostituzione con un residuo di glutammina fa si che l’enzima mantenga solamente circa lo 0,4% dell’attività catalitica rispetto alla forma wild-type.
L’anione tiolato S48 entra quindi in contatto, mediante interazioni non covalenti, con l’anello flavinico in vicinanza della sua posizione 4a (vedi fig. 4), ossia una coppia di elettroni di S48, che funge da donatore di elettroni, è parzialmente trasferita all’anello flavinico ossidato, che a sua volta funge da accettore di elettroni. La struttura derivante è chiamata complesso a trasferimento di carica.
Nel frattempo la catena laterale fenolica della Tyr181 continua a bloccare l’accesso all’anello flavinico, proteggendolo così dall’ossidazione da parte di O2.

Complesso della Piruvato Deidrogenasi
Fig. 15 – Ossidazione della Diidrolipoammide da parte di E3

Riassumendo, quello che si verifica è una reazione di interscambio di ponti disolfuro che porta alla formazione della forma ossidata della lipoammide, il primo prodotto, che è rilasciata, e della forma ridotta della diidrolipoil deidrogenasi.

La seconda semireazione comporta la riduzione del NAD+ a NADH + H+ mediante il trasferimento di elettroni dal disolfuro reattivo dell’enzima via FAD.

Complesso della Piruvato Deidrogenasi
Fig. 16 – Ossidazione di E3 Ridotta mediante NAD+

Il tutto ha inizio con l’ingresso nel sito attivo del NAD+ ed il suo legame a formare il complesso EH2●NAD+. Si noti che l’ingresso del coenzima determina lo spostamento a lato della catena laterale fenolica della Tyr181 ad opera dell’anello nicotinammidico.
A seguito del collasso del complesso a trasferimento di carica si forma un legame covalente tra il C-4a dell’anello flavinico ed S48, a cui si accompagna l’estrazione di un protone da parte dell’N-5 flavinico, con formazione del corrispondente anione tiolato S43.
S43 porta un attacco nucleofilo ad S48, attacco che determina la formazione del ponte disolfuro redox-attivo tra la Cys43 e la Cys48, cui segue la rottura del legame covalente tra S48 e il C-4a dell’anello flavinico a dare l’anione FADH, con carica negativa su N-1. Si noti che la diidrolipoil deidrogenasi è nuovamente nella forma ossidata (E).

Complesso della Piruvato Deidrogenasi
Fig. 17 – FADH-

Il FADH ha un’esistenza transitoria in quanto si verifica il trasferimento praticamente immediato del protone legato ad N-5, in forma di ione idruro, al C-4 dell’anello nicotinamidico, che è giustapposto all’N-5 flavinico. Questo porta alla formazione di FAD e del secondo prodotto della reazione, il NADH, che lascia l’enzima.
In definitiva gli elettroni che sono stati rimossi dal gruppo idrossietilico derivato dal piruvato passano, via FAD, al NAD+. In questo modo si è completato il ciclo catalitico della diidrolipoil deidrogenasi, essendo l’enzima ed il suo coenzima nella loro forma ossidata. A questo punto anche il ciclo catalitico dell’intero complesso della piruvato deidrogenasi si è completato, ed il complesso stesso è pronto per un altro ciclo di reazioni.

Nota: a differenza dell’anello tiazolico della tiamina pirofosfato, il FAD non ha la funzione di “trappola” o “pozzo” per gli elettroni quanto piuttosto di condotta per gli elettroni tra il disolfuro redox-attivo, nella sua forma ridotta, ed il NAD+.

Nota: il meccanismo catalitico della diidrolipoil deidrogenasi è stato in gran parte determinato in analogia con quello della glutatione reduttasi (EC 1.8.1.7), al 33% identica ma strutturalmente molto meglio caratterizzata. Va tuttavia notato che, sebbene i due enzimi catalizzino reazioni simili, queste normalmente corrono in direzione opposta:

  • la diidrolipoil deidrogenasi utilizza il NAD+ per ossidare due gruppi –SH a dare un disolfuro (–S–S–);
  • la glutatione reduttasi utilizza il NADPH per ridurre un –S–S– a due gruppi tiolici.

Nonostante ciò, i siti attivi dei due enzimi sono strettamente sovrapponibili.

Regolazione dell’attività del complesso della piruvato deidrogenasi

Nei mammiferi, la regolazione dell’attività del complesso della piruvato deidrogenasi è essenziale, sia nello stato di digiuno che in quello alimentato. Infatti, il complesso multienzimatico svolge un ruolo centrale nel metabolismo in quanto, catalizzando la decarbossilazione ossidativa irreversibile del piruvato, rappresenta la porta di ingresso dello scheletro carbonioso dei carboidrati e di circa il 50% dello scheletro carbonioso degli amminoacidi glucogenici, che nell’insieme costituiscono circa il 60% dell’apporto calorico giornaliero, verso:

  • il ciclo dell’acido citrico, e quindi alla completa ossidazione a CO2;
  • la sintesi degli lipidi (nello stato alimentato) e dell’acetiolcolina (vedi sopra).

L’importanza della regolazione della conversione del piruvato in acetil-CoA è sottolineata anche dal fatto che i mammiferi, sebbene siano in grado di produrre glucosio dal piruvato, non sono in grado di farlo dall’acetil-CoA, sia a causa della irreversibilità della reazione catalizzata dalla piruvato deidrogenasi che dell’assenza di vie metaboliche alternative in grado di farlo. L’inibizione dell’attività del complesso permetterà quindi di risparmiare glucosio e gli aminoacidi che possono essere convertiti in piruvato, come l’alanina, quando sono disponibili altri carburanti, ad esempio l’acetil-CoA derivante dall’ossidazione degli acidi grassi.
Per questi motivi l’attività del complesso è finemente regolata attraverso:

Regolazione dell’attività del complesso della piruvato deidrogenasi attraverso inibizione da prodotto finale e stato energetico della cellula

L’attività della forma defosforilata del complesso della piruvato deidrogenasi è regolata attraverso inibizione a feed-back o inibizione da prodotto finale.
Acetil-CoA e NADH inibiscono allostericamente gli enzimi che ne catalizzano la sintesi, rispettivamente diidrolipoil transacetilasi e la diidrolipoil deidrogenasi.
Inoltre, il CoA e l’acetil-CoA, così come il NAD+ ed il NADH, competono per i siti di legame sui rispettivi enzimi, i quali catalizzano reazioni reversibili. Questo significa che, in presenza di elevati valori dei rapporti [NADH]/[NAD+] e [Acetil-CoA]/[CoA], le reazioni di transacetilazione e deidrogenazione vanno nella direzione opposta rispetto a quella della formazione dell’acetil-CoA; di conseguenza la diidrolipoil transacetilasi non può accettare il gruppo idrossietilico dalla TPP in quanto è mantenuta nella forma acetilata. Questo fa si che la tiamina pirofosfato rimanga legata alla piruvato deidrogenasi nella sua forma idrossietilica, il che a sua volta riduce la velocità di decarbossilazione del piruvato. Quindi, elevati valori dei rapporti [NADH]/[NAD+] e [Acetil-CoA]/[CoA] influenzano indirettamente l’attività della piruvato deidrogenasi.

Complesso della Piruvato Deidrogenasi
Fig. 18 – PDC: Inibizione a Feed-back

Acetil-CoA e NADH sono prodotti anche durante l’ossidazione degli acidi grassi, via metabolica che, al pari delle reazioni catalizzate dal complesso della piruvato deidrogenasi, si verifica nel mitocondrio. Questo significa che la cellula, attraverso la regolazione dell’attività del complesso multienzimatico, è in grado di preservare le riserve di carboidrati quando sono disponibili acidi grassi per la produzione di energia. Questo per esempio è quanto accadde nel digiuno, quando il fegato, il muscolo scheletrico e molti altri organi e tessuti si affidano principalmente all’ossidazione degli acidi grassi per la produzione di energia. Di contro, l’attività del complesso è aumentata nello stato alimentato, quando molti differenti tipi di cellule e tessuti utilizzano in prevalenza il glucosio come fonte di energia.
Più in generale, quando la produzione di NADH e/o acetil-CoA supera la capacità della cellula di utilizzarli per la produzione di ATP, l’attività del complesso della piruvato deidrogenasi è inibita. Analogo discorso vale nella condizione in cui non ci sia necessità di produrre ulteriore ATP. Infatti l’attività catalitica del complesso multienzimatico è sensibile anche allo stato energetico della cellula. Attraverso meccanismi allosterici, elevati livelli di ATP inibiscono l’attività della componente piruvato deidrogenasi del complesso multienzimatico, mentre elevati livelli di ADP, che segnalano che la cellula potrebbe entrare in una fase di carenza di energia, lo attivano, indirizzando quindi lo scheletro carbonioso dei carboidrati e di alcuni aminoacidi verso la produzione di energia.

Nota: nel muscolo scheletrico l’attività del complesso della piruvato deidrogenasi aumenta con l’aumento dell’attività aerobica, il che si traduce in una maggiore dipendenza del muscolo dal glucosio come fonte di energia.

Regolazione dell’attività del complesso della piruvato deidrogenasi attraverso fosforilazione/defosforilazione

A differenza di quanto accade nei procarioti, nei mammiferi l’attività del complesso della piruvato deidrogenasi è regolata anche attraverso modificazioni covalenti, ossia fosforilazioni e defosforilazioni di tre specifici residui di serina presenti sulla subunità α della piruvato deidrogenasi, l’enzima che catalizza il primo passaggio, irreversibile dell’intera sequenza di reazioni.
Nota: poiché la piruvato deidrogenasi dei mammiferi è un eterotetramero, ci sono sei potenziali siti di fosforilazione.

Complesso della Piruvato Deidrogenasi
Fig. 19 – PDC: Regolazione Mediante Modificazione Covalente

La fosforilazione, che inattiva la piruvato deidrogenasi, e quindi blocca l’intera sequenza di reazioni, è catalizzata dalla piruvato deidrogenasi chinasi. Due delle suddette serine si trovano su una delle due anse presenti all’ingresso del canale per il substrato che porta al rispettivo sito attivo, quella più vicina all’estremità C-terminale, e la fosforilazione di uno solo di questi residui inattiva la piruvato deidrogenasi, dimostrando così la l’accoppiamento fuori fase tra i due siti attivi.
Nello stato defosforilato invece il complesso risulta attivo. La defosforilazione è catalizzata da una specifica protein fosfatasi, la piruvato deidrogenasi fosfatasi.
Le attività della piruvato deidrogenasi chinasi e della piruvato deidrogenasi fosfatasi sono a loro volta soggette a regolazione allosterica da parte di numero effettori.

Regolazione dell’attività della piruvato deidrogenasi chinasi

L’attività della piruvato deidrogenasi chinasi dipende dal valore dei rapporti [NADH]/[NAD+], [acetil-CoA]/[CoA], e [ATP]/[ADP], come anche dalla concentrazione del piruvato, nella matrice mitocondriale (vedi fig. 19).

  • Elevati valori dei rapporti [NADH]/[NAD+] e [acetil-CoA]/[CoA], come nel corso dell’ ossidazione degli acidi grassi e dei corpi chetonici, attivano la chinasi, la piruvato deidrogenasi viene fosforilata, e il complesso multienzimatico risulta inibito. Questo permette ai tessuti, come ad esempio il muscolo cardiaco, di risparmiare glucosio quando si stanno utilizzando acidi grassi e/o corpi chetonici per la produzione di energia, in quanto la sintesi di acetil-CoA dal piruvato, e quindi dai carboidrati (e da alcuni aminoacidi) e bloccata.
    Quando invece le concentrazioni di NAD+ e coenzima A sono elevate l’attività catalitica della chinasi è inibita ed il complesso risulta attivo.
    Quindi, acetil-CoA e NADH, due dei tre prodotti finali delle reazione catalizzate dal complesso della piruvato deidrogenasi, controllano allostericamente la propria sintesi regolando direttamente e indirettamente, tramite la regolazione dell’attività della piruvato deidrogenasi chinasi, l’attività del complesso multienzimatico.
  • Elevati valori del rapporto [ATP]/[ADP] attivano la chinasi, e quindi inibiscono il complesso multienzimatico.
    Nota: a differenza di molte altre chinasi, come quelle che intervengono nel controllo del metabolismo del glicogeno, la piruvato deidrogenasi chinasi non è regolata dai livelli di cAMP, bensì da molecole che segnalano variazioni nel livello della carica energetica della cellula e nella disponibilità di intermedi biosintetici, ossia rispettivamente ATP e NADH e acetil-CoA.
  • Il piruvato è un effettore allosterico negativo della piruvato deidrogenasi chinasi.
    Quando i suoi livelli sono elevati, il suo legame alla chinasi la inattiva, la piruvato deidrogenasi non viene fosforilata, ed il complesso della piruvato deidrogenasi rimane attivo.
  • La piruvato deidrogenasi chinasi è attivata anche a seguito dell’interazione con la diidrolipoil transacetilasi nella sua forma acetilata, ossia quando è presente la acetil-diidrolipoamide.

Altri attivatori della piruvato deidrogenasi chinasi sono gli ioni potassio e magnesio.

Regolazione dell’attività della piruvato deidrogenasi fosfatasi

L’attività della piruvato deidrogenasi fosfatasi dipende dal valore dei rapporti [NADH]/[NAD+] e [acetil-CoA]/[CoA], come anche dalla [Ca2+], nella matrice mitocondriale (vedi fig. 19).

  • Bassi valori dei rapporti [NADH]/[NAD+] e [acetil-CoA]/[CoA] attivano la fosfatasi, la piruvato deidrogenasi viene defosforilata, e il complesso multienzimatico risulta attivo.
    Al contrario, in presenza di elevati valori dei suddetti rapporti l’attività della fosfatasi si riduce, quella della chinasi aumenta, e il complesso multienzimatico viene inibito.
  • Lo ione calcio attiva la piruvato deidrogenasi fosfatasi.
    Ca2+ è un importante secondo messaggero che segnala la necessità da parte della cellula di ulteriore energia. Quindi, quando è presente in elevate concentrazioni, come nelle cellule muscolari cardiache a seguito della stimolazione da parte dell’adrenalina, o nella cellule muscolari scheletriche nel corso della contrazione muscolare, la fosfatasi è attiva, il complesso è defosforilato, e quindi attivato.
  • Anche l’insulina interviene nel controllo dell’attività catalitica del complesso della piruvato deidrogenasi attraverso l’attivazione della piruvato deidrogenasi fosfatasi. L’ormone, in risposta all’aumento della glicemia, stimola sia la sintesi del glicogeno che dell’acetil-CoA, precursore nella sintesi degli lipidi.

Anche il digiuno e la successiva rialimentazione influiscono sull’attività del complesso multienzimatico.
In tessuti come il muscolo scheletrico, il muscolo cardiaco o il rene, il digiuno riduce in modo significativo l’attività del complesso, mentre la rialimentazione inverte la situazione.
Nel cervello invece non si osservano queste variazioni poiché l’attività del complesso della piruvato deidrogenasi è essenziale per la produzione di ATP.

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Via del pentoso fosfato

La via del pentoso fosfato, anche detta via del fosfogluconato, è una via metabolica, comune a tutti gli organismi viventi, per il metabolismo ossidativo del glucosio alternativa alla glicolisi da cui si ramifica a livello del glucosio-6-fosfato, e le cui funzioni principali sono la produzione, in rapporti variabili, di NADPH, un coenzima ridotto, e ribosio-5-fosfato, uno zucchero fosforilato a cinque atomi di carbonio, ossia un pentoso fosfato, da cui il nome della via.

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 1 – Via del Pentoso Fosfato

In aggiunta alla produzione di NADPH e ribosio-5-fosfato, questa via metabolica ha altre funzioni, sia anaboliche che cataboliche.

  • In molti batteri e nei lieviti è coinvolta nel catabolismo degli zuccheri a cinque atomi di carbonio ribosio, xilosio e arabinosio.
    Anche nell’uomo questa è coinvolta nel catabolismo dei suddetti pentosi e dei meno comuni zuccheri a tre, quattro e sette atomi di carbonio assunti con la dieta, nonché per il catabolismo dei:

pentosi derivanti dal catabolismo dei carboidrati strutturali;
ribosio-5-fosfato derivante dal catabolismo dei nucleotidi.

  • Negli organismi fotosintetici contribuisce all’incorporazione dell’anidride carbonica (CO2) nella molecola del glucosio nel corso del ciclo di Calvin.
  • Porta alla sintesi oltre che di ribosio-5-fosfato, anche di altri intermedi utilizzati in vari processi biosintetici come:

eritrosio-4-fosfato, utilizzato per la sintesi dei tre aminoacidi aromatici triptofano, tirosina e fenilalanina;
ribulosio-5-fosfato, utilizzato per la sintesi della riboflavina;
sedoeptulosio-7-fosfato che, nei batteri Gram-negativi, è utilizzato per la sintesi delle unità di eptosio dello strato lipopolisaccaridico della membrana esterna.

La via del fosfogluconato, ramificandosi dalla glicolisi, è anche detta shunt dell’esoso monofosfato, dove shunt può essere tradotto come derivazione o smistamento.

E’ stato stimato che più del 10% del glucosio metabolizzato è trasportato attraverso questa via metabolica che, degno di nota, pur ossidando il monosaccaride non comporta alcuna produzione diretta, ma neppure consumo, di ATP.

INDICE

La delucidazione della via del pentoso fosfato

Le prime evidenze dell’esistenza della via del fosfogluconato emersero negli anni trenta del secolo scorso dagli studi di Otto Warburg, premio Nobel per la Fisiologia o la Medicina nel 1931, che scoprì il NADP durante studi sull’ossidazione del glucosio-6-fosfato a 6-fosfogluconato.
Ulteriori indicazioni emersero dall’osservazione che nei tessuti il glucosio continuava ad essere metabolizzato anche in presenza di inibitori della glicolisi, quali gli ioni fluoruro e iodoacetato, inibitori rispettivamente della enolasi (EC 4.2.1.11) e della gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (EC 1.2.1.12).
Tuttavia la delucidazione completa della via avvenne solo negli anni cinquanta del secolo scorso grazie al lavoro di diversi ricercatori e principalmente dei gruppi di Efraim Racker, Fritz Lipmann, vincitore del premio Nobel per la Fisiologia o la Medicina nel 1953 anche grazie alla scoperta del coenzima A, Bernard Horecker e Frank Dickens.

Funzioni del NADPH e del ribosio-5-fosfato

Il NADPH è necessario per le biosintesi riduttive, quali la sintesi degli acidi grassi, del colesterolo, degli ormoni steroidei e degli aminoacidi non essenziali prolina e tirosina, rispettivamente dal glutammato e dalla fenilalanina, nonché per la riduzione del glutatione ossidato. Nelle suddette reazioni il coenzima ridotto funge da donatore di elettroni, o meglio da donatore di uno ione idruro (:H), equivalente ad un protone e due elettroni.

Nicotinammide Adenina Dinucleotide Fosfato
Fig. 2 – NADPH

Nota: nei vertebrati circa la metà del NADPH necessario per i passaggi riduttivi della sintesi degli acidi grassi deriva dalla via del pentoso fosfato, mentre la restante parte dalla reazione catalizzata dall’enzima malico (EC 1.1.1.40), di cui di seguito è indicata la reazione.

Malato + NADP+ ↔ Piruvato + NADPH + H++ HCO3

Il ribosio-5-fosfato viene utilizzato nella sintesi dei nucleotidi e degli acidi nucleici, DNA ed RNA, dell’ATP, di coenzimi come il coenzima A, il NAD, il NADP ed il FAD, e degli aminoacidi essenziali triptofano ed istidina.

Ribosio-5-fosfato
Fig. 3 – Ribosio-5-fosfato

Lo zucchero fosforilato non viene utilizzato direttamente come tale ma previa conversione, attivazione, a 5-fosforibosil-1-pirofosfato o PRPP, acronimo dell’inglese 5-phosphoribosyl 1-pyrophosphate, nella reazione catalizzata dalla ribosio fosfato pirofosfochinasi o PRPP sintetasi (EC 2.7.6.1).

Ribosio-5-fosfato + ATP → 5-Fosforibosil-1-pirofosfato + AMP

Dove avviene la via del pentoso fosfato?

Nelle cellule animali la via del pentoso fosfato, al pari della glicolisi, della sintesi degli acidi grassi, e della maggior parte delle reazioni della gluconeogenesi, avviene nel citosol, analogamente a quanto accade nei batteri. E, considerando glicolisi, gluconeogenesi e via del pentoso fosfato è possibile affermare che queste tre vie metaboliche sono collegate tra di loro tramite diversi enzimi e/o intermedi condivisi.
Nelle cellule vegetali la via del fosfogluconato avviene invece nei plastidi, ed i suoi intermedi possono raggiungere il citosol attraverso i pori di membrana di questi organelli.

Considerando invece la distribuzione tissutale nell’uomo, i livelli di espressione degli enzimi della via variano ampiamente da tessuto a tessuto.
Livelli relativamente elevati si ritrovano nel fegato, nella corteccia surrenale, nei testicoli e nelle ovaie, nella tiroide, nelle ghiandole mammarie durante l’allattamento e, nel sangue, nei globuli rossi. In tutte queste sedi è richiesto un apporto continuo di NADPH per sostenere le biosintesi riduttive e/o per contrastare gli effetti dei radicali liberi dell’ossigeno o ROS, acronimo dell’inglese reactive oxygen species, su strutture cellulari sensibili come il DNA, i lipidi di membrana e le proteine, attraverso la riduzione del glutatione ossidato (GSSG) nella reazione catalizzata dalla glutatione reduttasi (EC 1.8.1.7).

GSSG + NADPH + H+ → 2 GSH + NADP+

Nota: il glutatione è il principale antiossidante nei globuli rossi, come nella maggior parte della altre cellule. La molecola è un tripeptide, la g-glutammil-cisteinilglicina, che nello stato ridotto presenta nel residuo di cisteina un gruppo sulfidrilico (-SH), da cui l’abbreviazione GSH.

L’azione di contrasto sugli effetti dei ROS è particolarmente importante in cellule come i globuli rossi e le cellule della cornea e del cristallino che sono direttamente esposte all’ossigeno.
Elevati livelli degli enzimi di questa via metabolica sono presenti anche in cellule in rapida divisione quali quelle dell’embrione nelle prime fasi di sviluppo, gli enterociti, le cellule della pelle e del midollo osseo e, in condizioni patologiche, le cellule tumorali, tutte cellule che richiedono elevate quantità di ribosio-5-fosfato per la sintesi dei nucleotidi.
Di contro nel muscolo scheletrico sono presenti livelli estremamente bassi degli enzimi della via del pentoso fosfato, via che in questa sede è praticamente assente e dove il glucosio-6-fosfato è utilizzato principalmente per la produzione di energia attraverso la glicolisi ed il ciclo dell’acido citrico.

Le due fasi della via del pentoso fosfato

Dal punto di vista concettuale, nella via del pentoso fosfato è possibile individuare due fasi.

  • Nella prima fase, la fase ossidativa, una molecola di glucosio-6-fosfato, uno zucchero fosforilato a 6 atomi di carbonio, viene convertita in una di ribulosio-5-fosfato, uno zucchero fosforilato a 5 atomi di carbonio, con la concomitante produzione di due molecole di NADPH e la liberazione del C-1 del glucosio in forma di CO2.
  • Nella seconda fase, la fase non ossidativa, viene prodotta una varietà di carboidrati fosforilati il cui destino dipende dalle necessità relative di NADPH, ribosio-5-fosfato e ATP da parte della cellula.

Le tappe della fase ossidativa della via del pentoso fosfato

La fase ossidativa della via del fosfogluconato si compone di tre tappe, due ossidazioni irreversibili, rispettivamente la prima e la terza reazione, ed una idrolisi.

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 4 – Fase Ossidativa della Via del Pentoso Fosfato

Di seguito sono descritti i meccanismi di reazione e, per quanto riguarda la glucosio-6-fosfato deidrogenasi o G6PD, acronimo dell’inglese glucose 6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.49), anche la regolazione dell’attività enzimatica.

Ossidazione del glucosio-6-fosfato a 6-fosfoglucono-δ-lattone

Nella prima tappa della fase ossidativa, il glucosio-6-fosfato viene ossidato a 6-fosfoglucono-δ-lattone, un estere intramolecolare, reazione catalizzata dalla glucosio-6-fosfato deidrogenasi.
Nella reazione il NADP+ funge da agente riducente accettando uno ione idruro dal carbonio 1 del glucosio-6-fosfato, e riducendosi quindi a NADPH.

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 5 – Glucosio-6-fosfato Deidrogenasi

Si noti che questa è la prima molecola di NADPH prodotta nella via del pentoso fosfato.

La reazione catalizzata dalla glucosio-6-fosfato deidrogenasi è una reazione “esclusiva” della via del pentoso fosfato. Analogamente a quanto accade nella maggior parte delle altre vie metaboliche, anche in questo caso, la prima reazione esclusiva della via è essenzialmente irreversibile, con un ΔG nel fegato pari a -4,21 kcal/mol (-17,6 kJ/mol), ed altamente regolata per via allosterica. L’enzima infatti rappresenta il principale punto di controllo del flusso di metaboliti attraverso la via stessa.
Nell’uomo i livelli più elevati di G6PD sono presenti nei neutrofili e macrofagi, cellule fagocitarie in cui, durante l’infiammazione, il NADPH viene utilizzato per la produzione di radicali superossido (O2.) dall’ossigeno molecolare nella reazione catalizzata dalla NADPH ossidasi (EC 1.6.3.1 ).

2 O2 + NADPH → 2 O2. + NADP+ + H+

Di seguito i radicali superossido potranno essere utilizzati per la sintesi, a scopi difensivi, ossia l’uccisione dei microrganismi fagocitati, di altri ROS come anche di radicali liberi dell’azoto o RNS, acronimo dell’inglese reactive nitrogen species, quali:

  • il perossido di idrogeno o acqua ossigenata (H2O2), nella reazione catalizzata dalla superossido dismutasi o SOD (EC 1.15.1.1)

2 O2. + 2 H+ → H2O2 + O2

  • il perossinitrito (O=N–O–O), a seguito della reazione con il monossido di azoto (•NO)

O2. + •NO → O=N–O–O

  • il radicale idroperossido (HOO•)

O2. + H+ → HOO•

Meccanismo catalitico della glucosio-6-fosfato deidrogenasi

Il meccanismo catalitico dell’enzima è stato ampiamente studiato nel microorganismo Leuconostoc mesenteroides, la cui glucosio-6-fosfato deidrogenasi ha la peculiare caratteristica di poter utilizzare come coenzima il NAD+ e/o il NADP+.

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 6 – G6PD: Meccanismo Catalitico

L’enzima non necessita della presenza di ioni metallici per la propria attività; uno dei residui presenti nel sito attivo funge da base generale, ossia è in grado di estrarre uno ione idruro dal gruppo ossidrilico legato al C-1 del glucosio-6-fosfato.
Nell’enzima batterico questo è effettuato dall’atomo Nɛ2 dell’anello imidazolico della catena laterale di un residuo di istidina, azoto che presenta un doppietto elettronico disponibile portare un l’attacco nucleofilo. Questa fa si che il glucosio-6-fosfato, un emiacetale ciclico con il C-1 nello stato di ossidazione aldeidico, sia ossidato ad estere ciclico, ossia un lattone. Ciò consente il trasferimento dello ione idruro legato al C-1 del glucosio sul C-4 dell’anello nicotinamidico del NADP+ a dare NADPH.
Poiché l’istidina suddetta è conservata in molte delle glucosio-6-fosfato deidrogenasi sequenziate, è probabile che questo meccanismo catalitico sia generalizzabile a tutte le glucosio-6-fosfato deidrogenasi.

Regolazione della glucosio-6-fosfato deidrogenasi

La glucosio-6-fosfato deidrogenasi rappresenta l’enzima chiave nella regolazione del flusso metabolico attraverso la via del pentoso fosfato, e quindi il principale punto di controllo della velocità di produzione del NADPH.
Nell’uomo l’enzima è presente in due forme: quella monomerica, inattiva, e in un equilibrio tra una forma dimerica ed una tetramerica, le conformazioni attive.
Uno dei principali modulatori della sua attività è il rapporto citosolico NADP+/NADPH. Elevati livelli di NADPH inibiscono l’enzima poiché il coenzima ridotto è un potente inibitore competitivo della G6PD, mentre il NADP+ è necessario sia per la sua attività catalitica che per il mantenimento della conformazione attiva. Infatti il legame del coenzima ossidato ad un sito specifico, distante dal sito attivo ma vicino all’interfaccia del dimero, è necessario per mantenerne la conformazione dimerica.

Fig. 7 – Regolazione dell’Attività della G6PD

Nella maggior parte delle condizioni metaboliche il rapporto NADP+/NADPH è basso, meno NADP+ è disponibile per legarsi all’enzima e di conseguenza si riduce l’attività dell’enzima stesso, a prescindere dai livelli della sua espressione genica. In queste condizioni la fase ossidativa è praticamente inattiva.
Se invece si considerano cellule in cui siano particolarmente attive vie metaboliche e/o reazioni che utilizzano NADPH, si verifica la riduzione della sua concentrazione citosolica, un aumento di quella del NADP+ e quindi una stimolazione dell’attività dell’enzima. Ne consegue un’attivazione della fase ossidativa della via dell’esoso monofosfato.
Quindi è anche possibile affermare che il destino del glucosio-6-fosfato, un intermedio comune alla glicolisi e alla via del fosfogluconato, dipende anche dal fabbisogno contingente di NADPH.
Un secondo meccanismo di regolazione dell’attività della glucosio-6-fosfato deidrogenasi chiama in causa l’accumulo di acil-CoA, intermedi nella sintesi degli acidi grassi. Queste molecole, legandosi alla forma dimerica dell’enzima ne causano la dissociazione nei due monomeri costitutivi, e quindi la perdita dell’attività catalitica.
L’insulina up-regola l’espressione del gene per la glucosio-6-fosfato deidrogenasi e per la 6-fosfogluconato deidrogenasi, per cui l’ormone, nello stato ben alimentato, concorre ad aumentare il flusso di carbonio attraverso la via del pentoso fosfato, promuovendo quindi la sintesi di NADPH.
Nota: l’insulina promuove anche la sintesi degli acidi grassi.

Idrolisi del 6-fosfoglucone-δ-lattone a 6-fosfogluconato

Nella seconda tappa della fase ossidativa si verifica l’idrolisi del 6-fosfoglucone-δ-lattone a dare il 6-fosfogluconato, una molecola lineare. Il 6-fosfoglucone-δ-lattone è di per se idroliticamente instabile e va incontro ad una idrolisi spontanea che apre l’anello, reazione che avviene ad una velocità significativa. Tuttavia nella cellula la reazione è accelerata dall’azione catalitica di una specifica lattonasi (EC 3.1.1.31).

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 8 – Lattonasi

Decarbossilazione ossidativa del 6-fosfogluconato a ribulosio-5-fosfato

Nella terza tappa della fase ossidativa si verifica la decarbossilazione ossidativa del 6-fosfogluconato a dare ribulosio-5-fosfato, un cheto pentoso, una molecola di CO2 e una di NADPH. La reazione è catalizzata dalla 6-fosfogluconato deidrogenasi (EC 1.1.1.44), enzima che richiede la presenza di ioni magnesio, Mg2+.

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 9 – 6-Fosfogluconato Deidrogenasi

Si noti che questa è la seconda molecola di NADPH prodotta nella via del pentoso fosfato.

Meccanismo catalitico della 6-fosfogluconato deidrogenasi

Il meccanismo catalitico, simile a quello dell’enzima del ciclo dell’acido citrico isocitrico deidrogenasi (EC 1.1.1.41), consiste in una catalisi acido/base e procede attraverso tre passaggi in cui sono coinvolti in particolare due residui conservati presenti nel sito attivo, una lisina (Lys) ed un glutammato (Glu), nell’uomo rispettivamente la Lys185 e il Glu192. La lisina agisce sia come  acido che come base mentre il glutammato come acido.

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 10 – 6-Fosfogluconato Deidrogenasi: Meccanismo Catalitico

Nel primo passaggio, il passaggio ossidativo, il 6-fosfogluconato viene ossidato in un β-cheto acido, il 3-cheto-6-fosfogluconato.
In questo passaggio l’ε-amino gruppo della catena laterale del suddetto residuo di lisina funge da base, da nucleofilo, estraendo un protone dal gruppo ossidrilico legato sul C-3, cui segue il trasferimento dello ione idruro legato al C-3 sul C-4 dell’anello nicotinamidico del NADP+. In questo modo si viene a formare il 3-cheto intermedio ed una molecola di NADPH che lascia il sito attivo.
Nel secondo passaggio, il passaggio decarbossilativo, il 3-cheto-6-fosfogluconato, che è estremamente suscettibile a decarbossilazione, perde, in forma di CO2, il C-1 del glucosio-6-fosfato a dare il cis-1,2-enediolo del ribulosio-5-fosfato, un intermedio ad elevata energia. In questo passaggio la lisina agisce come acido donando un protone all’ossigeno carbonilico legato al C-3.
Infine l’enzima catalizza una conversione stereospecifica enolo-chetone con formazione del ribulosio-5-fosfato. In questo passaggio il residuo di acido glutammico suddetto funge da acido donando un protone al C-1 del cis-1,2-enediolo, mentre l’ε-amino gruppo della lisina accetta un protone dal gruppo ossidrilico legato sul C-2. Il risultato è la formazione del ribulosio-5-fosfato.

Nota: un enediolo è un composto organico contenente due atomi di carbonio uniti da un doppio legame ed un gruppo ossidrile (-OH) legato ad ognuno dei due atomi di carbonio. L’enediolo può avere configurazione cis o trans.

Enedioli
Fig. 11 – Enedioli: Configurazioni Cis e Trans

Ad esempio, nel mondo vegetale molti polifenoli possiedono strutture enedioliche.

Dunque, la fase ossidativa della via del pentoso fosfato termina con la produzione del ribulosio-5-fosfato che è il substrato di partenza per le reazioni della fase non ossidativa.
L’equazione complessiva della fase ossidativa è:

3 Glucosio-6-fosfato + 6 NADP+ + H2O  → 6 NADPH + 6 H+ + 3 CO2 + 3 Ribulosio-5-fosfato

Le tappe della fase non ossidativa della via del pentoso fosfato

La fase non ossidativa della via si compone di cinque tappe, tutte facilmente reversibili, nel corso delle quali si verifica una serie di interconversioni di zuccheri fosforilati.
Questa fase ha inizio con due possibili reazioni a carico del ribulosio-5-fosfato: una isomerizzazione e una epimerizzazione che portano alla formazione rispettivamente di ribosio-5-fosfato e xilulosio-5-fosfato.

Nota: le reazioni enzimatiche di isomerizzazione ed epimerizzazione svolgono un ruolo importante nel metabolismo dei carboidrati.
Le Epimerasi (EC 5.1), un sottogruppo delle Isomerasi (EC 5.), catalizzano l’inversione reversibile della configurazione di un atomo di carbonio asimmetrico, in genere attraverso la rimozione e l’aggiunta di un atomo di idrogeno.
Nelle reazioni di isomerizzazione lo scambio di gruppi chimici si verifica tra atomi di carbonio.

Isomerizzazione del ribulosio-5-fosfato a ribosio-5-fosfato

Nella reazione di isomerizzazione il ribulosio-5-fosfato, un chetoso, viene convertito nell’aldoso corrispondente, il ribosio-5-fosfato. La reazione è catalizzata dalla fosfopentoso isomerasi o ribosio-5-fosfato isomerasi (EC 5.3.1.6).

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 12 – Fosfopentoso Isomerasi

Meccanismo catalitico della ribosio-5-fosfato isomerasi

Il meccanismo catalitico, simile a quello dell’enzima glicolitico fosfoglucosio isomerasi (EC 5.3.1.9), procede attraverso la formazione dell’intermedio ad alta energia cis-1,2-enediolo del ribulosio-5-fosfato. La formazione del cis-1,2-enediolo è conseguente ad un meccanismo di trasferimento protonico comune alle isomerizzazione aldoso-chetoso.
Di seguito viene descritto il possibile meccanismo catalitico dell’enzima di E. coli nella direzione della formazione del ribulosio-5-fosfato dal ribosio-5-fosfato, che è anche la direzione seguita nel ciclo di Calvin della fotosintesi.

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 13 – Fosfopentoso Isomerasi: Meccanismo Catalitico

Il primo passaggio consiste nell’apertura dell’anello furanosico del ribosio-5-fosfato, apertura rara in soluzione acquosa (<0.5%), ed indotta dall’interazione con un residuo di acido aspartico (Asp81) che accetta un protone dal gruppo idrossilico legato al C-1, mentre è probabile che sia l’acqua il donatore di un protone.
Una volta aperta la catena un residuo di acido glutammico (Glu103) funge da base generale, da nucleofilo, estraendo il protone legato sul C-2, mentre Asp81 dona un protone. Come risultato si forma il cis-1,2-enediolo.
Di seguito, la base iniziale, Glu103 adesso protonata, funge da acido e dona un protone al C-1 dell’intermedio enediolico, mentre Asp81 funge da base generale accettando un protone dal gruppo ossidrilico legato al C-2. Il risultato è la formazione del ribulosio-5-fosfato.

Il meccanismo di reazione per la sintesi del ribosio-5-fosfato dal ribulosio-5-fosfato è semplicemente l’inverso di quanto appena descritto.

Epimerizzazione del ribulosio-5-fosfato a xilulosio-5-fosfato

L’altro destino metabolico del ribulosio-5-fosfato nella via del pentoso fosfato è quello di essere epimerizzato a xilulosio-5-fosfato, un chetoso come il ribulosio-5-fosfato, nella reazione catalizzata dalla fosfopentoso epimerasi (EC 5.1.3.1).

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 14 – Fosfopentoso Epimerasi

Nota: lo xilulosio-5-fosfato, oltre ad essere un intermedio della via del pentoso fosfato ha anche azione regolatoria: stimola la glicolisi ed inibisce la gluconeogenesi, intervenendo nel controllo della concentrazione del fruttosio-2,6-bisfosfato nel fegato.

Meccanismo catalitico della fosfopentoso epimerasi

Anche questa reazione, come quelle catalizzate dalla 6-fosfogluconato deidrogenasi e dalla ribosio-5-fosfato isomerasi, procede attraverso la formazione di un intermedio enediolico, ma con il doppio legame non tra i carboni 1 e 2  ma tra quelli 2 e 3.
Quello che accade nel corso della reazione è che un residuo aminoacidico presente nel sito attivo dell’enzima funge da base generale, da nucleofilo, ed estrae un protone dal C-3, il che porta alla formazione dell’intermedio cis-2,3-enediolico. Di seguito un residuo aminoacidico acido dona un protone al C-3, ma sul lato opposto, e dunque determinando l’inversione della configurazione sul C-3 a formare lo xilulosio-5-fosfato.

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 15 – Fosfopentoso Epimerasi: Meccanismo Catalitico

Arrivati a questo punto la via dell’esoso monofosfato ha portato alla formazione, per ogni molecola di glucosio-6-fosfato metabolizzata, di:

  • un pool di tre pentoso-5-fosfati, ossia ribulosio-5-fosfato, ribosio-5-fosfato e xilulosio-5-fosfato, che coesistono all’equilibrio;
  • 2 molecole di NADPH.

Nelle tre tappe successive, dalla sesta all’ottava, la  transchetolasi (EC 2.2.1.1) e la transaldolasi (EC 2.2.1.2), enzimi esclusivi della via del pentoso fosfato, catalizzano una serie di riarrangiamenti degli scheletri carboniosi che porteranno alla formazione di unità carboniose a tre, quattro, sei e sette atomi che potranno essere utilizzate per vari scopi metabolici, a seconda delle necessità della cellula.
In termini di analisi dei flussi di metaboliti tra le differenti vie metaboliche, l’azione concertata della transchetolasi e della transaldolasi permette l’interazione della via del pentoso fosfato, in particolare la sua fase non ossidativa, con la glicolisi, e la gluconeogenesi, nonché con le vie che portano alla formazione di numerose vitamine, coenzimi e precursori degli acidi nucleici.

La Transchetolasi: tappe 6 e 8

La transchetolasi è l’enzima che catalizza la tappa limitante della fase non ossidativa della via del pentoso fosfato, ed il primo enzima che agisce a valle delle reazioni catalizzate dalla ribosio-5-fosfato isomerasi e della fosfopentoso epimerasi.
Scoperta indipendentemente nel 1953 da Horecker e Racker, e così chiamata da quest’ultimo, catalizza, nella sesta ed ottava tappa, il trasferimento di unità a due atomi di carbonio da un donatore chetoso, ossia lo xilulosio-5-fosfato, il sedoeptulosio-7-fosfato o il fruttosio-6-fosfato, ad un aldoso accettore, ribosio-5-fosfato, gliceraldeide-3-fosfato o eritrosio-4-fosfato.

Transchetolasi
Fig. 16 – Transchetolasi: Reazione Generale

Considerando come esempi le reazioni “in avanti”, nella sesta tappa il chetoso donatore è lo xilulosio-5-fosfato mentre l’aldoso accettore è il ribosio-5-fosfato, a formare gliceraldeide-3-fosfato, il frammento a tre atomi di carbonio rimanente dello xilulosio-5-fosfato, e sedoeptulosio-7-fosfato, uno zucchero fosforilato a sette atomi di carbonio che sarà utilizzato nel passaggio successivo, il settimo;

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 17 – Transchetolasi: Sesta Tappa

Nell’ottava tappa il chetoso donatore è lo xilulosio-5-fosfato mentre l’aldoso accettore è l’eritrosio-4-fosfato, a dare una seconda molecola di gliceraldeide-3-fosfato ed una di fruttosio-6-fosfato.

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 18 – Transchetolasi: Ottava Tappa

Da notare che tre dei quattro prodotti delle reazioni catalizzate dalla transchetolasi, due molecole di gliceraldeide-3-fosfato ed una di fruttosio-6-fosfato, sono anche intermedi della glicolisi.

Transchetolasi e tiamina pirofosfato

La transchetolasi appartiene al gruppo degli enzimi che richiedono la tiamina pirofosfato o TPP, acronimo dell’inglese thiamine pyrophosphate, come cofattore.
La tiamina pirofosfato è la forma biologicamente attiva della tiamina o vitamina B1, ed è saldamente legata all’enzima.

Tiamina Pirofosfato
Fig. 19 – Tiamina Pirofosfato

Altri enzimi che richiedono la TPP come cofattore sono:

  • la piruvato decarbossilasi (EC 4.1.1.1), che interviene nella fermentazione alcolica;
  • la componente piruvato deidrogenasi o E1 (EC 1.2.4.1) del complesso della piruvato deidrogenasi;
  • la componente α-chetoacido deidrogenasi o subunità E1 (EC 1.2.4.4) del complesso della α-chetoacido deidrogenasi dei chetoacidi a catena ramificata;
  • la componente 2-chetoglutarato deidrogenasi o subunità E1 (EC 1.2.4.2) del complesso della α-chetoglutarato deidrogenasi, enzima del ciclo dell’acido citrico.

La funzione della tiamina pirofosfato è quella di contribuire al trasferimento di intermedi aldeidici attivati stabilizzando il carbanione a due atomi di carbonio che si forma durante la reazione.

Meccanismo catalitico della transchetolasi

L’atomo di carbonio compreso tra l’atomo di zolfo e quello di azoto dell’anello tiazolico della tiamina pirofosfato, ossia l’atomo C-2, è molto più acido rispetto alla maggior parte dei gruppi =C- presenti in altre molecole a causa dell’adiacente atomo di azoto caricato positivamente che stabilizza elettrostaticamente il carbanione derivante dalla dissociazione del protone. Questo fa si che l’atomo di idrogeno ad esso legato sia facilmente dissociabile a formare un carbanione, ossia un atomo di carbonio con carica negativa. L’estrazione del protone è catalizzata dalla transchetolasi
Il carbanione reagisce con il carbonio carbonilico del substrato chetonico, nella tappa 6 lo xilulosio-5-fosfato o il sedoeptulosio-7-fosfato nella reazione in direzione opposta, oppure, considerando la tappa 8, di nuovo lo xilulosio-5-fosfato o il fruttosio-6-fosfato nella reazione in direzione opposta.
Prendendo come esempio la reazione “in avanti” della tappa 6, il composto di addizione tra la tiamina pirofosfato e lo xilulosio-5-fosfato va incontro a frammentazione a seguito della scissione del legame C2-C3 dello xilulosio-5-fosfato, a dare gliceraldeide-3-fosfato, che è rilasciata, e un’unità a due atomi di carbonio, un gruppo idrossietilico con carica negativa, che rimane legato al C-2 dell’anello tiazolico.

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 20 – Transchetolasi: Meccanismo Catalitico

La carica negativa presente sull’intermedio idrossietilico, ossia l’intermedio carbanionico, viene stabilizzata dall’anello tiazolico della tiamina pirofosfato grazie alla presenza dell’atomo di azoto carico positivamente che funge da “trappola” o “pozzo” per gli elettroni. Quindi l’anello tiazolico fornisce una struttura elettron deficiente o elettrofila nella quale gli elettroni del carbanione possono delocalizzarsi per risonanza.
Nell’ultimo passaggio si verifica la condensazione tra il gruppo idrossietilico e il ribosio-5-fosfato, l’aldeide accettore, attraverso l’attacco del carbanione sul carbonio aldeidico del ribosio-5-fosfato, a formare un addotto covalente legato alla tiamina pirofosfato.
La successiva scissione dell’addotto porta alla liberazione di sedoeptulosio-7-fosfato, rigenerando il carbanione della tiamina pirofosfato.

Nota: la transchetolasi può utilizzare come substrati, oltre allo xilulosio-5-fosfato, al sedoeptulosio-7-fosfato e al fruttosio-6-fosfato anche altri 2-chetozuccheri nonché diversi altri aldoso fosfati, agendo in modo simile a quanto appena visto.

Carbanioni e carbocationi

Un carbanione è una specie chimica  contenente un carbonio trivalente con carica negativa.
Si tratta di un intermedio di reazione estremamente reattivo, derivante dalla rottura eterolitica di un legame tra un atomo di carbonio ed un altro atomo o gruppo.
I carbanioni, disponendo di una coppia elettronica non condivisa, sono dei potenti nucleofili, e delle basi forti, ed attaccano, al fine di formare un legame covalente, un protone o un centro elettrofilo, come un centro polarizzato o carico positivamente. Data la loro forte reattività, con l’esclusione di poche eccezioni, sono intermedi transienti nelle reazioni organiche, al pari dei radicali liberi e dei carbocationi.
Un carbocatione è una specie chimica  contenente un carbonio trivalente con carica positiva. Al pari dei radicali liberi, i carbocationi sono specie caratterizzate da una lacuna elettronica, avendo nell’orbitale di valenza non otto elettroni ma solo sei elettroni. I radicali liberi invece presentano nell’orbitale di valenza sette elettroni. A causa di questa lacuna elettronica entrambe le specie sono potenti elettrofili, e, al pari dei carbanioni, sono intermedi di reazione estremamente reattivi. Nel corso delle reazioni accettano elettroni, uno i radicali liberi, due i carbocationi, al fine di raggiungere la struttura elettronica stabile dell’ottetto.

Considerando due atomi legati da un legame covalente, esistono due possibili modi per rompere suddetto legame: l’omolisi e l’eterolisi.

  • Nell’omolisi, a seguito della rottura del legame, ciascun atomo prende uno dei due elettroni di legame. Le due molecole formatesi hanno quindi un numero dispari di elettroni, ossia un elettrone spaiato, e sono senza carica; tali specie sono definite radicali liberi.
  • Nell’eterolisi la rottura del legame porta invece alla formazione di due molecole dotate di carica, ossia due ioni, un catione ed un anione, in quanto entrambe gli elettroni di legame sono presi da una delle due specie prodotte.
Omolisi ed Eterolisi
Fig. 21 – Omolisi ed Eterolisi

Nota: la scissione eterolitica è più comune di quella omolitica.

La transaldolasi: tappa 7

La transaldolasi, scoperta nel 1953 da Horecker e Smyrniotis nel lievito Saccharomyces cerevisiae, interviene nella settima tappa della via del pentoso fosfato dove catalizza il trasferimento di una unità a tre atomi di carbonio da un substrato donatore, il sedoeptulosio-7-fosfato, ad un substrato accettore, la gliceraldeide-3-fosfato, a dare fruttosio-6-fosfato ed eritrosio-4-fosfato.

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 22 – Transaldolasi

Da notare che, in analogia con quanto visto per le reazioni catalizzate dalla transchetolasi, anche in questo caso il donatore dell’unità carboniosa trasferita è un chetoso mentre l’accettore è un aldoso.
Nella reazione in direzione opposta il chetoso donatore sarà il fruttosio-6-fosfato mentre l’aldoso accettore l’eritrosio-4-fosfato.

Meccanismo catalitico della transaldolasi

A differenza della transchetolasi, la transaldolasi non necessita per la propria attività della presenza di cofattori.
La reazione si compone di una parte equivalente ad una scissione aldolica e di una equivalente ad una condensazione aldolica. Di seguito verrà analizzato il meccanismo di catalitico della transaldolasi B di E. coli, considerando la reazione nella direzione della formazione dell’eritrosio-4-fosfato e del fruttosio-6-fosfato.
Nel primo passaggio l’ε-amino gruppo della catena laterale di un residuo di lisina (Lys132) presente nel sito attivo, a seguito del trasferimento di un protone ad un residuo di acido glutammico (Glu96), trasferimento mediato da una molecola d’acqua, porta un attacco nucleofilo al C-2 del sedoeptulosio-7-fosfato, il carbonio carbonilico. Il risultato è la formazione di una carbinolammina con il sedoeptulosio-7-fosfato.

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 23 – Transaldolasi: Meccanismo Catalitico

Segue la perdita di una molecola d’acqua dalla carbinolammina con formazione di una immina, o base di Schiff, legata all’enzima; anche in questo passaggio interviene il trasferimento di un protone da Glu96 alla molecola d’acqua “catalitica”.
Nota: l’intermedio covalente enzima-substrato che si è formato è simile a quello che quello che si forma nella reazione catalizzata dalla aldolasi (EC 4.1.2.13) nella quarta tappa della glicolisi.
Nel passaggio successivo, il gruppo carbossilico di un residuo di acido aspartico (Asp17) estrae un protone dal gruppo idrossilico legato sul C-4, con conseguente rottura del legame covalente tra C-3 e C-4, una scissione aldolica che porta alla liberazione dell’aldoso eritrosio-4-fosfato, il primo prodotto della reazione, mentre rimane legato all’enzima un carbanione a tre atomi di carbonio che è stabilizzato per risonanza, analogamente a quanto visto per la transchetolasi. Infatti, al pari dell’atomo di azoto dell’anello tiazolico della tiamina pirofosfato, anche l’atomo di azoto con carica positiva della base di Schiff agisce da trappola per gli elettroni stabilizzando la carica negativa del carbanione.
Una volta che il secondo substrato, la gliceraldeide-3-fosato, si trova in posizione nel sito attivo, il carbanione porta un attacco nucleofilo al carbonio carbonilico della gliceraldeide-3-fosfato a formare, mediante una condensazione aldolica, un nuovo legame C-C e un chetoso legato all’enzima.
Infine l’idrolisi della base di Schiff porta al rilascio del fruttosio-6-fosfato, un chetoso ed il secondo prodotto della reazione, e permette l’inizio di un nuovo ciclo di reazione.

A questo punto, come visto in precedenza, nell’ottava tappa della via del pentoso fosfato, interviene nuovamente la transchetolasi che catalizza la formazione di fruttosio-6-fosfato e glicealdeide-3-fosfato a partire da eritrosio-4-fosfato e xilulosio-5-fosfato.

Regolazione della via del pentoso fosfato

Il glucosio-6-fosfato è un metabolita che può entrare sia nella glicolisi che nella via del pentoso fosfato a seconda dei fabbisogni relativi di ATP, NADPH e ribosio-5-fosfato da parte della cellula.
Nel caso di un aumentato fabbisogno di ATP, la maggior parte del glucosio-6-fosfato sarà incanalata nella via glicolitica.
Se invece sono aumentati i fabbisogni di NADPH e/o ribosio-5-fosfato, la maggior parte dello zucchero fosforilato sarà incanalato nella via del pentoso fosfato.
Dal punto di vista molecolare il destino del glucosio-6-fosfato dipende in larga parte dalle attività relative degli enzimi che lo metabolizzano nella via glicolitica e nello shunt dell’esoso monofosfato, rispettivamente la fosfofruttochinasi-1 o PFK-1,  acronimo dell’inglese phosphofructokinase-1 (EC 2.7.1.11), e la glucosio-6-fosfato deidrogenasi, enzimi la cui attività è altamente regolata.

Nota: sebbene nella via glicolitica il glucosio-6-fosfato sia substrato della fosfoglucosio isomerasi, questo enzima catalizza la sua isomerizzazione reversibile in fruttosio-6-fosfato, quest’ultimo substrato della fosfofruttochinasi-1.

La PFK-1 è inibita quando aumenta la concentrazione dell’ATP e/o di citrato, ossia quando la carica energetica della cellula è alta, mentre è attivata quando aumenta la concentrazione dell’AMP e/o del fruttosio-2,6-bisfosfato, ossia quando la carica energetica della cellula è bassa. Ne consegue che, quando la carica energetica della cellula è alta il flusso di carbonio, e quindi di glucosio-6-fosfato, attraverso la glicolisi si riduce.
La glucosio-6-fosfato deidrogenasi è invece inibita dal NADPH e dagli acil-CoA, intermedi nella biosintesi degli acidi grassi. Se quindi la concentrazione citosolica del NADPH aumenta il flusso di glucosio-6-fosfato attraverso la via del pentoso fosfato è inibito. Viceversa, se i livelli di NADPH cadono, l’inibizione viene meno, la via si “riaccende” e vengono sintetizzati NADPH e ribosio-5-fosfato.

Tuttavia, anche quando la glucosio-6-fosfato deidrogenasi è attiva, la cellula è ancora in grado di rispondere al quelle che sono le necessità relative di NADPH, ribosio-5-fosfato ed ATP regolando di conseguenza il flusso di carbonio attraverso la via del fosfogluconato. E, in base alle necessità della cellula di NADPH, ribosio-5-fosfato ed ATP, quello che accadrà è una “combinazione” di alcune reazioni della via glicolitica, della gluconeogenesi e della via del pentoso fosfato al fine di sintetizzare i metaboliti richiesti, sfruttando anche il fatto che la fase non ossidativa dello shunt dell’esoso monofosfato è controllata essenzialmente dalla disponibilità dei substrati.
Di seguito sono analizzate le quattro principali possibilità.

Il fabbisogno di NADPH è molto maggiore di quello di ribosio-5-fosfato e ATP

Quando il fabbisogno di NADPH è molto maggiori di quello di ribosio-5-fosfato e la cellula non ha bisogno di ulteriore produzione di ATP, ossia la carica energetica della cellula è alta, il glucosio-6-fosfato entra nella via del pentoso fosfato e può essere completamente ossidato a CO2. Una condizione metabolica del genere si ritrova ad esempio nel tessuto adiposo nel corso di una intensa sintesi di acidi grassi.
Nella fase ossidativa della via, per ogni molecola di glucosio-6-fosfato ossidata a ribulosio-5-fosfato, sono prodotte due molecole di NADPH. Attraverso una combinazione delle reazione della fase non ossidativa e di alcune reazioni della gluconeogenesi, nello specifico quelle catalizzate dagli enzimi  trioso fosfato isomerasi (EC 5.3.1.1), aldolasi (EC 4.1.2.13), fosfoglucosio isomerasi (EC 5.3.1.9), e fruttosio-1,6-bisfosfatasi (EC 3.1.3.11), sei molecole di ribulosio-5-fosfato vengono convertite in cinque di glucosio-6-fosfato. E’ quindi anche possibile affermare che le reazioni della fase non ossidativa permettono alle reazioni della fase ossidativa di procedere.
In questo processo è possibile individuare tre gruppi di reazioni che operano in sequenza.

  • Nel primo gruppo si ritrovano le reazioni catalizzate dagli enzimi della fase ossidativa, e si ha la formazione di due molecole di NADPH ed una di ribulosio-5-fosfato.

6 Glucosio-6-fosfato + 12 NADP+ + 6 H20 → 6 Ribulosio-5-fosfato + 6 CO2 + 12 NADPH + 12 H+

6 Ribulosio-5-fosfato → 4 Fruttosio-6-fosfato + 2 Gliceraldeide-3-fosfato

  • Infine, attraverso le suddette reazioni della gluconeogenesi il fruttosio-6-fosfato e la gliceraldeide-3-fosfato sono “riciclati” a glucosio-6-fosfato, di modo che il ciclo possa ricominciare.

4 Fruttosio-6-fosfato + 2 Gliceraldeide-3-fosfato + H2O → 5 Glucosio-6-fosfato + Pi

Sommando le ultime due reazioni si evince che sei molecole di ribulosio-5-fosfato sono convertite in cinque di glucosio-6-fosfato.

6 Ribulosio-5-fosfato + H2O → 5 Glucosio-6-fosfato + Pi

Dalla somma delle reazioni del primo, secondo e terzo gruppo si ottiene la reazione complessiva:

Glucosio-6-fosfato + 12 NADP+ + 7 H20 → 6 CO2 + 12 NADPH + 12 H+ + Pi

Dunque, una molecola di glucosio-6-fosfato, attraverso sei cicli della via del pentoso fosfato accoppiati con alcune reazioni della reazioni gluconeogenesi, sarà convertita in 6 molecole di CO2, con la concomitante produzione di 12 molecole di NADPH, ma nessuna produzione netta di ribosio-5-fosfato.

Il fabbisogno di NADPH ed ATP è molto maggiore di quello di ribosio-5-fosfato

Quando il fabbisogno di NADPH è molto maggiore di quello di ribosio-5-fosfato e la carica energetica della cellula è bassa, ossia la cellula necessita di ATP, il ribulosio-5-fosfato prodotto nella fase ossidativa viene convertito in fruttosio-6-fosfato e gliceraldeide-3-fosfato attraverso le reazioni della fase non ossidativa. Di seguito i due intermedi, attraverso le reazioni della glicolisi, sono ossidati a piruvato con concomitante produzione di ATP.
La reazione complessiva è:

3 Glucosio-6-fosfato + 6 NADP+ + 5 NAD+ + 5 Pi + 8 ADP → 5 Piruvato + 3 CO2 + 6 NADPH + 5 NADH + 8 ATP + 2 H2O + 8 H+

Se la cellula necessita di altro ATP, il piruvato prodotto potrà essere ossidato attraverso il ciclo dell’acido citrico. Se invece non è necessario produrre ulteriore ATP, il piruvato potrà essere utilizzato come precursore in diverse vie biosintetiche.

Da notare che anche in questo caso, come nel precedente, non si verifica alcuna produzione netta di ribosio-5-fosfato.

Il fabbisogno di ribosio-5-fosfato è molto maggiore di quello di NADPH

Quando il fabbisogno di ribosio-5-fosfato è molto maggiore rispetto a quello di NADPH, come nelle cellule che si dividono rapidamente, nelle quali è quindi in corso una rapida sintesi di nucleotidi precursori del DNA, le reazioni della fase ossidativa della via del pentoso fosfato non hanno luogo, e non vi è sintesi di NADPH. Al contrario, poiché le reazioni della fase non ossidativa sono facilmente reversibili, la riduzione della concentrazione del ribosio-5-fosfato, causata dal suo rapido utilizzo, avrà come effetto quello di stimolarne la sintesi.
Quello che accade è che, attraverso la via glicolitica, molto del glucosio-6-fosfato viene convertito in fruttosio-6-fosfato e gliceraldeide-3-fosfato. A questo punto la transaldolasi e la transchetolasi portano alla sintesi di ribosio-5-fosfato e xilulosio-5-fosfato. Quest’ultimo, attraverso le reazione catalizzate dalla fosfotopentoso epimerasi e di seguito dalla ribosio-5-fosfato isomerasi, verrà convertito in ribosio-5-fosfato.
La reazione complessiva è:

6 Glucosio-6-fosfato + ATP → 6-Ribosio-5-fosfato + ADP + H+

In questo caso quindi quello che si verifica è una combinazione di reazioni della glicolisi e della fase non ossidativa della via del fosfogluconato, con queste ultime nella direzione della sintesi del ribosio-5-fosfato.
Da notare che nessun metabolita torna alla glicolisi.

I fabbisogni di ribosio-5-fosfato e NADPH si equivalgono

Se una molecola di ribosio-5-fosfato e due molecole di NADPH per molecola di glucosio-6-fosfato metabolizzata sono sufficienti a soddisfare le necessità metaboliche della cellula, quello che si verifica sono le prime quattro reazioni della via del pentoso fosfato, ossia l’intera fase ossidativa, più la reazione catalizzata dalla ribosio-5-fosfato isomerasi.
La reazione complessiva è:

Glucosio-6-fosfato + 2 NADP+ + H2O → Ribosio-5-fosfato + 2 NADPH + 2 H+ + CO2

Anche in questa condizione metabolica nessun metabolita torna alla glicolisi.

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Glicolisi

La glicolisi, dal greco glykys, dolce e lysis, sciogliere, può essere definita come la sequenza di reazioni enzimatiche che, nel citosol della cellula, anche in assenza di ossigeno, porta alla conversione di una molecola di glucosio, un composto a sei atomi di carbonio, in due di piruvato, un composto a tre atomi di carbonio, con la concomitante produzione di due molecole di ATP, la moneta di scambio energetico della cellula.

Glicolisi
Fig. 1 – La Via Glicolitica

La glicolisi, che si è evoluta prima che nell’atmosfera si accumulasse una quantità sostanziale di ossigeno, è la via metabolica con il maggior flusso di carbonio nella maggior parte degli esseri viventi, ed è presente in quasi tutti gli organismi.
Grazie al fatto di poter procedere in assenza di ossigeno, ha svolto un ruolo cruciale nei processi metabolici durante i primi due miliardi di anni di evoluzione della vita sulla terra, e probabilmente rappresenta il modo più antico che gli organismi hanno sviluppato per ottenere energia dalle molecole organiche quando la disponibilità del gas è scarsa. E’ inoltre una fonte di precursori per il catabolismo aerobico e per vari processi biosintetici.
Nota: la glicolisi è conosciuta anche come la via di Embden-Meyerhof, dal nome dei due ricercatori che delucidarono l’intero processo nel muscolo.

INDICE

Glicolisi: la prima via metabolica ad essere delucidata

Lo sviluppo della biochimica è andato di pari passo con la comprensione del metabolismo del glucosio e in particolare della glicolisi, la prima via metabolica ad essere stata chiarita.
Sebbene la delucidazione di questa via fu completata negli anni quaranta del secolo scorso, la scoperta chiave sul metabolismo del glucosio venne fatta in modo casuale nel 1897, a seguito di un problema sorto un anno prima quando un chimico tedesco, M. Hahn, nel tentativo di ottenere e conservare estratti proteici privi di cellule dal lievito, incontrò difficoltà nella loro conservazione. Un suo collega, Hans Buchner, ricordando quanto veniva, e viene tuttora fatto per la conservazione delle marmellate, suggerì di addizionare saccarosio all’estratto.

Eduard Buchner
Fig. 2 – Eduard Buchner

Eduard Buchner, fratello di Hans, mise in pratica l’idea di Hans, osservando però che dalla soluzione si sviluppavano bollicine. Questo indusse Eduard a concludere che fosse in corso una fermentazione, per l’epoca una scoperta sorprendente. Infatti sino ad allora la fermentazione, secondo quanto affermato da Pasteur nel 1860, era stata inestricabilmente legata alle cellule viventi, mentre ora veniva dimostrato che poteva avvenire anche al di fuori delle cellule stesse. In breve, questi due ricercatori demolirono il dogma vitalistico e diedero il via alla moderna biochimica.
Eduard Buchner grazie a queste ricerche fu insignito del premio Nobel per la Chimica nel 1907, e fu il primo di una serie di ricercatori che vinsero il premio grazie alle loro scoperte sulla via glicolitica.
In seguito fu dimostrato, lavorando con estratti muscolari, che molte delle reazioni della fermentazione lattica erano le stesse della fermentazione alcolica, il che evidenziò l’esistenza di una unità nella biochimica.
Come anticipato, la glicolisi fu poi chiarita in modo esaustivo nella prima metà del secolo scorso in gran parte grazie al lavoro di ricercatori quali Gerty and Carl Cori, Carl Neuberg, Arthur Harden, William Young, Jacob Parnas, Otto Warburg, Hans von Euler-Chelpin, Gustav Embden e Otto Meyerhof.

Perché la glicolisi è importante

La glicolisi è una via metabolica essenziale sia dal punto di vista energetico che come fonte di precursori per diverse altre vie metaboliche. E la velocità del flusso di carbonio attraverso di essa, ossia la velocità con cui il glucosio viene convertito in piruvato, è regolata in modo da soddisfare queste due necessità fondamentali della cellula.
Dal punto di vista energetico, sebbene sia un processo relativamente inefficiente, può avvenire in assenza di ossigeno, la condizione in cui si è sviluppata la vita sulla Terra e in cui tutt’oggi molte cellule, sia eucariote che procariote, si ritrovano. Di seguito alcuni esempi.

  • I muscoli di molti animali presentano una anaerobiosi dipendente dall’attività, ossia possono funzionare in assenza di ossigeno per brevi periodi. Ad esempio, quando gli animali, ma anche gli atleti, compiono esercizi molto intensi, il loro fabbisogno di ATP aumenta più rapidamente della capacità del corpo di rifornire di ossigeno il muscolo. In questa situazione il muscolo ricava l’energia metabolica necessaria al suo funzionamento in modo anaerobico, appunto attraverso la sola glicolisi.
    Un altro esempio è la cornea dell’occhio, un tessuto scarsamente vascolarizzato.
  • Molti microorganismi, come quelli che vivono in ambienti quali il suolo, le profondità marine ma anche i pori della pelle, si ritrovano in zone in cui l’ossigeno è scarso o assente. Ed esistono microrganismi, definiti anaerobi obbligati, che non possono sopravvivere in presenza di ossigeno, una molecola altamente reattiva; esempi sono il batterio responsabile della gangrena gassosa, Clostridium perfringens, del tetano, Clostridium tetani, e del botulismo, Clostridium botulinum.

Va inoltre sottolineato che la glicolisi gioca un ruolo centrale anche in tutte quelle cellule e tessuti nei quali il glucosio rappresenta la sola fonte di energia, come:

  • i globuli rossi, privi di mitocondri;
  • le cellule spermatiche;
  • il cervello, che solo in particolari condizioni può usare anche i corpi chetonici per produrre energia;
  • la midollare del surrene.

Una situazione simile si ritrova anche nel mondo vegetale dove molte piante acquatiche e alcuni tessuti vegetali specializzati nell’accumulo di amido, come i tuberi delle patate, utilizzano il glucosio come principale fonte di energia.

Nota: esistono organismi che sono anaerobi facoltativi, ossia possono sopravvivere in presenza ed in assenza di ossigeno, come gli animali appartenenti al genere Mytilus, che quindi mostrano un funzionamento anaerobico dipendente dall’ambiente, o anaerobico habitat-dipendente, una situazione simile a quanto visto in precedenza nel muscolo sottoposto a lavori molto intesi.

Infine non va dimenticato che in condizioni aerobiche, nelle cellule dotate di mitocondri, la via glicolitica rappresenta la parte iniziale della via metabolica che porta alla completa ossidazione del glucosio ad anidride carbonica (CO2) ed acqua a scopi energetici.

Glicolisi
Fig. 3 Glicolisi: Fonte di Precursori Biosintetici

Diversi intermedi glicolitici, come il glucosio-6-fosfato (G-6-P, acronimo dell’inglese glucose 6-phosphate), il fruttosio-6-fosfato (F-6-P, acronimo dell’inglese fructose 6-phosphate), il diidrossiacetone fosfato (DHAP, acronimo dell’inglese dihydroxyacetone phosphate) o il piruvato possono essere utilizzati come precursori biosintetici in vie metaboliche quali ad esempio quelle che portano alla sintesi del glicogeno, degli acidi grassi, dei trigliceridi, dei nucleotidi, di alcuni amminoacidi, o del 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-BPG, acronimo dell’inglese 2,3-bisphosphoglycerate).

Le tappe della glicolisi

Le 10 tappe che compongono la glicolisi possono essere suddivise in due fasi.
La prima, detta fase preparatoria, si compone di 5 reazioni e comporta dapprima la conversione di una molecola di glucosio in una di fruttosio-1,6-bisfosfato (F-1,6-BP, acronimo dell’inglese fructose 1,6-bisphosphate), attraverso tre passaggi: una prima fosforilazione sul C-1, una isomerizzazione ed una seconda fosforilazione, stavolta sul C-6, con consumo complessivo di 2 ATP. Segue la scissione, la lisi, del fruttosio-1,6-bisfosfato in due intermedi fosforilati a tre atomi di carbonio, la gliceraldeide-3-fosfato ed il diidrossiacetone fosfato, ed infine l’isomerizzazione di quest’ultimo in gliceraldeide-3-fosfato. Dunque, nella fase preparatoria una molecola di glucosio viene scissa in due di gliceraldeide-3-fosfato e si consumano due ATP.
Nella seconda fase, detta fase di recupero energetico, composta dalle restanti 5 reazioni, le due molecole di gliceraldeide-3-fosfato sono convertite in altrettante molecole di piruvato, con concomitante produzione di 4 molecole di ATP. Quindi nella seconda fase si verifica l’estrazione e conservazione in forma di ATP di parte dell’energia chimica presente nella molecola del glucosio. Inoltre sono estratti anche equivalenti riducenti, immagazzinati nella molecola del NADH. Quello che sarà poi il destino del NADH dipende dal tipo di cellula e dalla presenza o meno di quantità adeguate di ossigeno.

Nota: nella via glicolitica è metabolizzato sia il glucosio di derivazione ematica, che entra nella cellula attraverso un trasporto mediato da specifici trasportatori proteici di membrana, che il glucosio-6-fosfato derivante dalla glicogenolisi.

Reazione 1: fosforilazione del glucosio a glucosio-6-fosfato

Nella prima tappa della via glicolitica il glucosio viene fosforilato a glucosio-6-fosfato a spese di una molecola di ATP.

Glucosio + ATP → Glucosio-6-fosfato + ADP + H+

Nella maggior parte delle cellule questa reazione è catalizzata dalla esochinasi (EC 2.7.1.1), enzima presente nelle cellule di tutti gli organismi, e negli esseri umani con quattro forme isoenzimatiche.
L’esochinasi e la piruvato chinasi (EC 2.7.1.40), l’altra chinasi della via glicolitica, al pari di molte altre chinasi, richiede per il corretto funzionamento la presenza dello ione magnesio (Mg2+) o di un altro ione metallico bivalente come il manganese (Mn2+). Considerando lo ione magnesio, questi si va a legare all’ATP a formare il complesso MgATP2-, che è il vero substrato dell’enzima. E va sottolineato che l’attacco nucleofilo da parte di un gruppo ossidrilico (-OH) del glucosio all’atomo di fosforo terminale dell’ATP è facilitato proprio dall’azione degli ioni magnesio che vanno ad interagire con le cariche negative dei gruppi fosforici del nucleoside trifosfato.
La formazione del legame fosfoestereo tra un gruppo fosforico ed il gruppo ossidrilico sul C-6 è termodinamicamente sfavorita e richiede energia per procedere, energia che è fornita dall’ATP. Infatti, mentre la fosforilazione del glucosio sul C-6 ad opera del solo fosfato inorganico ha un ΔG°’ pari a 3,3 kcal/mol (13,8 kJ/mol), ossia è una reazione endoergonica, l’idrolisi dell’ATP a dare ADP e Pi ha un ha un ΔG°’ pari -7,3 kcal/mol (30,5 kJ/mol), ossia è una reazione esoergonica. La reazione netta avrà un ΔG°’ = -7,3 + 3,3 = -4,0 kcal/mol (-30,5 + 13,8 = -16,7 kJ/mol). Nelle condizioni presenti nella cellula la reazione è ancora più favorevole, con un ΔG pari a -8,0 kcal/mol (-33,5 kJ/mol).
Dunque si tratta di una reazione essenzialmente irreversibile.

Nota: in biochimica le fosforilazioni sono reazioni fondamentali catalizzate da enzimi detti chinasi, una sottoclasse delle transferasi. Le chinasi catalizzano il trasferimento del gruppo fosforico terminale, o gruppo fosforico in posizione γ, di un nucleoside trifosfato ad un nucleofilo accettore a formare un legame fosfoestereo. Nello specifico, le esochinasi catalizzano il trasferimento del gruppo fosforico in posizione γ dell’ATP a vari zuccheri a sei atomi di carbonio, o esosi, tra cui, oltre ovviamente al glucosio, anche al fruttosio ed al mannosio.

Perché la fosforilazione del glucosio è importante?

La fosforilazione della molecola del glucosio è importante per almeno alcuni motivi.

  • Il glucosio-6-fosfato grazie alla sua carica negativa e all’assenza sulla membrana plasmatica di trasportatori per gli zuccheri fosforilati non può diffondere attraverso di essa. Quindi, dopo la fosforilazione iniziale non è più necessario spendere energia per mantenere la molecola fosforilata all’interno della cellula, nonostante la grande differenza esistente tra le sue concentrazioni intra- ed extracellulari.
    Considerazioni analoghe valgono per gli altri otto intermedi fosforilati che si ritrovano tra il glucosio-6-fosfato ed il piruvato.
  • La rapida fosforilazione del glucosio mantiene la concentrazione intracellulare dell’esoso bassa, favorendo così il suo passaggio all’interno della cellula.
  • La fosforilazione comporta l’aumento del contenuto in energia della molecola, ossia inizia a destabilizzarla, facilitandone il successivo metabolismo.

Altri destini metabolici del glucosio-6-fosfato

Il glucosio-6-fosfato rappresenta un punto di ramificazione importante del metabolismo del glucosio. Infatti, oltre che proseguire nella via glicolitica, in condizioni anaboliche, può avere destini differenti (vedi Fig. 3). Di seguito alcuni esempi.

  • Può essere utilizzato per la sintesi di:
    glicogeno, immagazzinato principalmente nel fegato e nel muscolo;
    polisaccaridi complessi presenti nella matrice extracellulare;
    galattosio;
    glucosammina ed altri zuccheri utilizzati per la glicosilazione delle proteine.
  • Può essere entrare nella via del pentoso fosfato, via attraverso la quale le cellule producono:

NADPH, necessario in generale per le biosintesi riduttive, come quella degli acidi grassi, del colesterolo, degli ormoni steroidei, e dei desossiribonucleotidi, ma anche indispensabile nella prevenzione del danno ossidativo in cellule come i globuli rossi;
riboso-5-fosfato, utilizzato nella sintesi dei nucleotidi ma anche del NADH, FADH2 e del coenzima A.

Reazione 2: isomerizzazione del glucosio-6-fosfato a fruttosio-6-fosfato

Nella seconda tappa della via glicolitica si verifica l’isomerizzazione del glucosio-6-fosfato, un aldoso, a fruttosio-6-fosfato, un chetoso, nella reazione catalizzata dalla fosfoglucosio isomerasi (EC 5.3.1.9).

Glucosio-6-fosfato ⇄ Fruttosio-6-fosfato

Come l’esochinasi, anche la fosfoglucosio isomerasi necessita della presenza di Mg2+.
Il ΔG°’ della reazione è pari a 0,4 kcal/mol (1,7 kJ/mol), mentre il ΔG è di -0,6 kcal/mol (-2,5 kJ/mol). Questo piccolo valore sta ad indicare che la reazione è prossima all’equilibrio ed è facilmente reversibile.
La reazione consiste essenzialmente nel passaggio del gruppo carbonilico  presente sul C-1 della forma a catena aperta del glucosio-6-fosfato al C-2 della forma a catena aperta del fruttosio-6-fosfato.
La reazione enzimatica può essere suddivisa in almeno tre passaggi. Poiché entrambe gli esosi in soluzione acquosa sono presenti principalmente nella forma ciclica, l’enzima deve dapprima aprirne l’anello, catalizzare l’isomerizzazione, e infine richiudere l’anello stesso, portando alla formazione dell’anello a 5 atomi di carbonio del fruttosio-6-fosfato.

Via Glicolitica
Fig. 4 – Reazione della Fosfoglucosio Isomerasi

Questa reazione di isomerizzazione è un passaggio cruciale per la via glicolitica in quanto prepara per le due tappe successive.
Perché?

  • La fosforilazione che si verifica nella reazione successiva, la terza, richiede la presenza di un gruppo alcolico sul C-1, e non di un gruppo carbonilico.
  • Nella quarta tappa si verifica la scissione del legame tra il C-3 ed il C-4, scissione facilitata dalla presenza del gruppo carbonilico sul C-2.

Reazione 3: fosforilazione del fruttosio-6-fosfato a fruttosio-1,6-bisfosfato

Nella terza tappa della via glicolitica si verifica una seconda reazione di fosforilazione nella quale il fruttosio-6-fosfato viene fosforilato sul C-1 a dare fruttosio-1,6-bisfosfato, a spese di una molecola di ATP. La reazione è catalizzata dalla fosfofruttochinasi-1 o PFK-1, acronimo dell’inglese phosphofructokinase-1 (EC 2.7.1.11).

Fruttosio-6-fosfato + ATP → Fruttosio-1,6-bisfosfato + ADP + H+

La PFK-1 è così chiamata per distinguerla dall’enzima che catalizza la fosforilazione del fruttosio-6-fosfato a fruttosio-2,6-bisfosfato, ossia la fosfofruttochinasi-2 o PFK-2 (EC 2.7.1.105).
Al pari della reazione catalizzata dalla esochinasi/glucochinasi, anche questa fosforilazione è un passaggio essenzialmente irreversibile della glicolisi, irreversibilità di nuovo assicurata dall’accoppiamento, grazie alla PFK-1, con l’idrolisi dell’ATP. Infatti la fosforilazione del fruttosio-6-fosfato ad opera del solo fosfato inorganico è una reazione endoergonica, con un ΔG°’ pari a 3,9 kcal/mol (16,3 kJ/mol), mentre, quando la reazione è accoppiata all’idrolisi dell’ATP, la reazione complessiva diviene esoergonica, con un ΔG°’ = 7,3-3,9 = -3,4 kcal/mol (-30,5 + 16,3 = -14,2 kJ/mol) e un ΔG di -5,3 kcal/mol (-22,2 kJ/mol).
Mentre la esochinasi permette alla cellula di “intrappolare” il glucosio al suo interno, la fosfofruttochinasi-1 evita che lo scheletro carbonioso del monosaccaride sia utilizzato per la sintesi del glicogeno o per la produzione di altri zuccheri), ma venga invece metabolizzato nella via glicolitica. Infatti, a differenza del glucosio-6-fosfato, il fruttosio-1,6-bisfosfato è un metabolita esclusivo della glicolisi/gluconeogenesi. In altri termini, la fosfofruttochinasi-1 catalizza la prima tappa di comando della via glicolitica. Reazioni di questo tipo sono di solito sono catalizzate da enzimi regolati per via allosterica, la cui regolazione impedisce l’accumulo sia dei prodotti intermedi che di quelli finali. La PFK-1 non fa eccezione essendo soggetta ad una fine regolazione allosterica da parte di numerosi metaboliti che segnalano il livello di energia e lo stato ormonale dell’organismo.

Alcuni batteri e protisti, e forse tutte le piante, posseggono una fosfofruttochinasi che utilizza, nella sintesi del fruttosio-1,6-bisfosfato, come donatore del gruppo fosforico non l’ATP ma il pirofosfato, una reazione con un ΔG°’ pari a -12,1 kcal/mol (-2,9 kJ/mol).

Fruttosio-6-fosfato + PPi → Fruttosio-1,6-bisfosfato + Pi

Nota: il prefisso bis– in bisfosfato, come fruttosio-1,6-bisfosfato, sta ad indicare la presenza di due gruppi fosforici separati, mentre il prefisso di– in difosfato, come in adenosina difosfato, indica che sono presenti due gruppi fosforici connessi da un legame anidridico a dare un gruppo pirofosforico.
Regole simili si applicano anche per la denominazione di molecole che presentano tre gruppi fosforici separati, come l’inositolo 1,4,5-trisfosfato, o connessi da legame anidridico come l’ATP o la guanosina trifosfato o GTP.

Reazione 4: scissione del fruttosio-1,6-bisfosfato

Nella quarta tappa della via glicolitica si verifica la scissione reversibile del fruttosio-1,6-bisfosfato in gliceraldeide-3-fosfato, un aldoso, e diidrossiacetone fosfato, un chetoso. La reazione è catalizzata dalla fruttosio-1,6-bisfosfato aldolasi o semplicemente aldolasi (EC 4.1.2.13), che catalizza la scissione del legame tra il C-3 ed il C-4.

Fruttosio-1,6-bisfosfato ⇄ Diidrossiacetone Fosfato + Gliceraldeide-3-fosfato

Tutti gli intermedi glicolitici a valle di questa reazione sono molecole a tre atomi di carbonio anziché a 6 come le precedenti.
Il ΔG°’ della reazione nella direzione della produzione di gliceraldeide-3-fosfato e diidrossiacetone fosfato è positivo, pari a 5,7 kcal/mol (23,8 kJ/mol), mentre la Km è pari a circa 10-4 M, valori che indicherebbero che la reazione non procede da sinistra verso destra. In realtà nelle normali condizioni cellulari, a causa delle basse concentrazioni dei reagenti presenti nella cellula, il ΔG è pari a -0,3 kcal/mol (-1,3 kJ/mol), un valore molto piccolo, per cui la reazione è facilmente reversibile, ossia essenzialmente all’equilibrio.

Nota: l’enzima aldolasi deriva il nome proprio nome dalla natura della reazione inversa, ossia una condensazione aldolica.

Reazione 5: isomerizzazione del diidrossiacetone fosfato a gliceraldeide-3-fosfato

Dei due prodotti della reazione catalizzata dalla aldolasi, la gliceraldeide-3-fosfato si trova sulla via diretta della glicolisi, al contrario del diidrossiacetone fosfato che come tale non può proseguire. Per farlo deve essere convertito, isomerizzato, a gliceraldeide-3-fosfato. Suddetta isomerizzazione avviene nella reazione catalizzata dalla trioso fosfato isomerasi (EC 5.3.1.1).

Diidrossiacetone fosfato ⇄ Gliceraldeide-3-fosfato

La trioso fosfato isomerasi, nel convertire il diidrossiacetone fosfato in gliceraldeide-3-fosfato, catalizza il trasferimento di un atomo di idrogeno dal C-1 a C-2, ossia una ossidoriduzione intramolecolare. In pratica l’enzima fa si che i carboni C-1, C-2 e C-3 della molecola di glucosio di partenza divengano equivalenti rispettivamente ai carboni C-6, C-5 e C-4.
Il risultato netto dell’azione della aldolasi e della trisofosfato isomerasi è dunque la produzione di due molecole di gliceraldeide-3-fosfato.
Il ΔG°’ della reazione è pari a 1,8 kcal/mol (7,5 kJ/mol), mentre il ΔG è pari a 0,6 kcal/mol (2,5 kJ/mol). All’equilibrio, circa il 96% del triosofosfato presente sarebbe rappresentato dal diidrossiacetone fosfato. Tuttavia ciò non accade, e la reazione procede rapidamente verso la formazione della gliceraldeide-3-fosfato grazie alla tappa successiva della via glicolitica che rimuove la gliceraldeide-3-fosfato prodotta.
Una delle caratteristiche distintive della trioso fosfato isomerasi è la sua grande capacità catalitica. L’enzima è infatti considerato cineticamente perfetto. Perché? Se si considera la velocità con cui avviene l’isomerizzazione in presenza di un catalizzatore basico come può essere l’acetone, l’enzima è in grado di accelerarla di un fattore 1010. Infatti, analizzando il rapporto Kcat/KM questi è pari a 2×108 M-1s-1, valore prossimo alla limite controllato dalla diffusione. Quindi, il passaggio limitante nella catalisi è l’incontro tra enzima e substrato controllato appunto dalla diffusione.
Considerando dal punto di vista energetico gli ultimi due passaggi della glicolisi, questi sono sfavorevoli, con ΔG°’ pari a 7,5 kcal/mol (31,3 kJ/mol), mentre il ΔG°’complessivo dei primi 5 passaggi è pari a 0,5 kcal/mol (2,1 kJ/mol), con una Keq complessiva di circa 0,43. Ed è l’energia libera derivante dall’idrolisi delle due molecole di ATP che, in condizioni standard, sposta la costante di equilibrio complessiva vicino ad uno. Se invece si considera il ΔG questi è ampiamente negativo, -13,6 kcal/mol (-56,8 kJ/mol).

Nota: il diidrossiacetone fosfato può anche essere ridotto a glicerolo-3-fosfato (vedi Fig. 3) nella reazione catalizzata dalla glicerolo-3-fosfafo deidrogenasi (EC 1.1.1.8).

Diidrossiacetone fosfato + NADH + H+ ⇄ Glicerolo-3-fosfato + NAD+

L’enzima fa da ponte tra il metabolismo glucidico e lipidico in quanto il glicerolo-3-fosfato prodotto è utilizzato nella sintesi di lipidi come i trigliceridi.
Questa via è particolarmente importante nel tessuto adiposo e nell’intestino tenue.

Reazione 6: da gliceraldeide-3-fosfato a 1,3-bisfosfoglicerato

Nella sesta tappa della via glicolitica, la prima della seconda fase, si verifica l’ossidazione della gliceraldeide-3-fosfato a dare 1,3-bisfosfoglicerato (1,3-BPG, acronimo dell’inglese 1,3-bisphosphoglycerate) e la concomitante riduzione del NAD+ a NADH. La reazione è catalizzata dalla gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (EC 1.2.1.12).

Gliceraldeide-3-fosfato + NAD+ + Pi ⇄ 1,3-Bisfosfoglicerato + NADH + H+

Questa reazione è la prima delle due reazione della glicolisi in cui viene resa disponibile l’energia chimica necessaria per la successiva sintesi dell’ATP; l’altra è quella catalizzata dalla enolasi (EC 4.2.1.11). Perché?
La reazione è la somma di due processi.

  • Nella prima reazione si verifica l’ossidazione del gruppo aldeidico a gruppo carbossilico, passaggio nel quale il NAD+ funge da agente ossidante. La reazione è fortemente esoergonica, con un ∆G’° di -10,3 kcal/mol (-43 kJ/mol).
  • Nella seconda reazione si verifica la formazione del legame tra l’ortofosfato ed il gruppo carbossilico sul C-1 dell’1,3-bisfosfoglicerato a dare un’anidride mista, detta acil fosfato. Questa reazione è fortemente endoergonica, con ∆G’° di 11,8 23kcal/mol (49,3 kJ/mol).

Affinché possa verificarsi la formazione dell’acil fosfato, le due reazioni precedenti non debbono avvenire in successione ma debbono essere accoppiate. In questo modo l’ossidazione dell’aldeide viene utilizzata per guidare la formazione dell’anidride mista, con un ΔG°’ complessivo leggermente endoergonico, 1,5 kcal/mol (6,3 kJ/mol), mentre il valore del ΔG è 0,6 kcal/mol (2,5 kJ/mol).
Dunque la maggior parte dell’energia libera derivante dall’ossidazione del gruppo aldeidico anziché dissiparsi in calore viene conservata  grazie alla formazione dell’acil fosfato.

Nota: la riduzione, reversibile dell’anello nicotinamidico del NAD+ o del NADP+ è conseguente alla perdita di due atomi di idrogeno da parte di un’altra molecola, in questo caso il gruppo aldeidico della gliceraldeide-3-fosfato, che quindi si ossida, e al successivo trasferimento di uno ione idruro, ossia due elettroni ed un protone, all’anello suddetto. L’H+ rimanente è rilasciato nel mezzo acquoso. Di seguito le semireazioni per entrambe i coenzimi.

NAD+ + 2 e + 2 H+ → NADH + H+

NADP+ + 2 e + 2 H+ → NADPH + H+

Reazione 7: fosfoglicerato chinasi e produzione di ATP

Nella settima tappa della via glicolitica si verifica il trasferimento del gruppo fosforico ad alta energia dall’acil fosfato dell’1,3-bisfosfoglicerato all’ADP con formazione di ATP e 3-fosfoglicerato. La reazione è catalizzata dalla fosfoglicerato chinasi (EC 2.7.2.3).

1,3-Bisfosfoglicerato + ADP + H+ ⇄ 3-Fosfoglicerato + ATP

Il ΔG°’ della reazione è pari a -4,4 kcal/mol (-18,5 kJ/mol), quindi si tratta di una reazione esoergonica. Il ΔG è pari a 0,3 kcal/mol (1,3 kJ/mol).
L’elevato potenziale di trasferimento del gruppo fosforico dell’acil fosfato viene sfruttato per la fosforilazione dell’ADP, reazione definita fosforilazione a livello del substrato. In altri termini, parte dell’energia rilasciata nel corso dell’ossidazione del gruppo aldeidico nel passaggio precedente viene ora conservata attraverso la formazione di ATP dall’ADP e Pi.
La reazione catalizzata dalla fosfoglicerato chinasi è la prima delle due reazione della glicolisi in cui parte dell’energia chimica presente nella molecola del glucosio viene conservata in forma di ATP. E, poiché dall’azione dell’aldolasi e della trioso fosfato isomerasi, reazione 4 e 5, si formano due molecole di gliceraldeide-3-fosfato per molecola di glucosio, in questo passaggio sono prodotte due molecole di ATP che vanno a “pareggiare” le due molecole di ATP consumate nella fase preparatoria.
Nota: la fosfoglicerato chinasi prende il nome dalla reazione che procede nella direzione opposta rispetto a quella appena descritta, ossia la fosforilazione del 3-fosfoglicerato a dare 1,3-bisfosfoglicerato a spese di una  molecola di ATP. L’enzima infatti, al pari di tutti gli altri enzimi, è in grado di catalizzare la reazione in entrambe le direzioni. E la direzione che porta alla sintesi dell’1,3-bisfosfoglicerato è seguita durante la fissazione fotosintetica della CO2 e la gluconeogenesi.

La reazione sei e la sette nel loro insieme rappresentano un processo di accoppiamento energetico in cui l’intermedio comune è rappresentato dall’1,3-bisfosfoglicerato. Mentre la reazione che porta alla sintesi dell’1,3-bisfosfoglicerato è endoergonica, con un ΔG°’ = 1,5 kcal/mol (6,3 kJ/mol), la seconda è esoergonica, ΔG°’ = -4,4 kcal/mol (-18,5 kJ/mol). Il ΔG°’ complessivo è pari a (-4,4 + 1,5) = 2,9 kcal/mol (-18,5 + 6,3 = 12,2 kJ/mol), ossia la razione catalizzata dalla fosfoglicerato chinasi è sufficientemente esoergonica da “trascinare” anche la precedente, rendendo la reazione complessiva esoergonica.

Gliceraldeide-3-fosfato + ADP + Pi + NAD+ ⇄ 3-Fosfoglicerato + ATP + NADH + H+

In verità, la reazione della fosfoglicerato chinasi è sufficientemente esoergonica da trascinare anche le reazioni catalizzate dalla aldolasi e dalla trioso fosfato isomerasi.

Che cos’è la fosforilazione a livello del substrato?

Viene definita fosforilazione a livello del substrato la produzione di ATP a seguito del trasferimento di un gruppo fosforico da un substrato all’ADP, un processo che coinvolge enzimi solubili e intermedi chimici.
Esiste anche un secondo tipo di fosforilazione per la sintesi dell’ATP definita fosforilazione accoppiata alla catena respiratoria o fosforilazione ossidativa, che invece coinvolge enzimi di membrana e gradienti protonici transmembrana.

Poiché l’energia libera standard di idrolisi del gruppo fosforico sul C-3 del 3-fosfoglicerato è pari a -3 kcal/mol (-12,5 kJ/mol), non è possibile alcuna sintesi di ATP dall’ADP e dal 3-fosfoglicerato stesso. Le due reazioni successive della glicolisi porteranno alla conversione del 3-fosfoglicerato in fosfoenolpiruvato, una molecola con un potenziale di trasferimento del gruppo fosforico sufficientemente alto da permettere la sintesi di ATP.

Reazione 8: da 3-fosfoglicerato a 2-fosfoglicerato

Nell’ottava tappa della via glicolitica il 3-fosfoglicerato viene convertito in 2-fosfoglicerato, in una reazione reversibile catalizzata dalla fosfoglicerato mutasi (EC 5.4.2.1). La reazione richiede la presenza di Mg2+, ha un ΔG molto basso, pari a circa 0,2 kcal/mol (0,8 kJ/mol) ed un ΔG°’ pari a 1,1 kcal/mol (4,4 kJ/mol).
L’enzima è una mutasi, enzimi che catalizzano lo spostamento intramolecolare di un gruppo chimico, in questo caso lo spostamento di un gruppo fosforico dal C-3 al C-2 del 3-fosfoglicerato. A loro volta le mutasi sono una sottoclasse delle isomerasi.
Il meccanismo con cui si svolge questa reazione dipende dal tipo di organismo considerato. Ad esempio, nel lievito o nel muscolo di coniglio la reazione avviene in due passaggi e comporta la formazione di un intermedio fosfo-enzima. Nella prima parte della reazione un gruppo fosforico legato covalentemente ad un residuo di istidina presente nel sito attivo viene trasferito all’ossidrile presente sul C-2 del 3-fosfoglicerato a dare il 2,3-bisfosfoglicerato. Nel passaggio successivo l’enzima opera come una fosfatasi convertendo il 2,3-bisfosfoglicerato in 2-fosfoglicerato; tuttavia il gruppo fosforico presente sul C-3 non viene rilasciato ma si lega al residuo di istidina del sito attivo a rigenerare l’intermedio enzima-His-fosfato. Schematicamente:

Enzima-His-fosfato + 3-Fosfoglicerato ⇄ Enzima-His + 2,3-Fosfoglicerato

Enzima-His + 2,3-Bisfosfoglicerato ⇄ Enzima-His-fosfato + 2-Fosfoglicerato

Vale la pena notare che il gruppo fosforico del 2-fosfoglicerato prodotto non è lo stesso di quello del substrato 3-fosfoglicerato.
All’incirca una volta ogni 100 passaggi catalitici il 2,3-bisfosfoglicerato si dissocia dal sito attivo dall’enzima, lasciandolo privo dell’istidina fosforilata, e quindi in forma inattiva. L’enzima in forma inattiva può essere riattivato dal 2,3-BPG, che è quindi necessario sia sempre presente in piccole quantità. E il 2,3-bisfosfoglicerato è in effetti presente in piccole quantità nella maggior parte delle cellule, tranne i globuli rossi, dove agisce anche come inibitore allosterico riducendo l’affinità dell’emoglobina per l’ossigeno, e dove la sua concentrazione è di circa 4-5 mM.

Nota: il 3-fosfoglicerato, oltre che proseguire nella via glicolitica, può essere utilizzato anche per la sintesi della serina, da cui derivano glicina e cisteina (vedi Fig. 3). La sintesi della serina ha inizio con la reazione catalizzata dalla fosfoglicerato deidrogenasi (EC 1.1.1.95), in cui si verifica l’ossidazione del 3-fosfoglicerato a 3-fosfoidrossipiruvato e la concomitante riduzione del NAD+ a NADH. Questa reazione costituisce anche il passaggio limitante dell’intera via biosintetica, in quanto la serina inibisce l’attività della deidrogenasi.

Sintesi del 2,3-bisfosfoglicerato e lo shunt glicolitico di Rapoport-Luebering

L’1,3-bisfosfoglicerato può essere convertito, oltre che in 3-fosfoglicerato, anche in 2,3-bisfosfoglicerato (vedi Fig. 3).
Nei globuli rossi la reazione è catalizzata dalla bisfosfoglicerato mutasi, una delle tre isoforme con cui nei mammiferi è presente la fosfoglicerato mutasi. L’enzima necessita della presenza del 3-fosfoglicerato in quanto catalizza il trasferimento intermolecolare di un gruppo fosforico dal C-1 dell’1,3-bisfosfoglicerato al C-2 del 3-fosfoglicerato. Nella reazione quindi il 3-fosfoglicerato di partenza diviene il 2,3-BPG, mentre l’1,3-BPG diviene il nuovo 3-fosfoglicerato. L’attività di mutasi dell’enzima è riconosciuta come EC 5.4.2.4.

Glicolisi
Fig. 5 – Sintesi del 2,3-Bisfosfoglicerato

Il 2,3-bisfosfoglicerato può essere quindi idrolizzato a dare 3-fosfoglicerato nella reazione catalizzata dall’attività fosfatasica della bisfosfoglicerato mutasi, che rimuove il gruppo fosforico in posizione C-2. Tale attività è riconosciuta come EC 3.1.3.13. L’enzima è anche capace di catalizzare l’interconversione del 2-fosfoglicerato e 3-fosfoglicerato per cui è un enzima trifunzionale. Il 3-fosfoglicerato può quindi rientrare nella via glicolitica. Questa deviazione dalla glicolisi, chiamata anche ciclo o shunt glicolitico di Rapoport-Luebering, porta si alla sintesi del 3-fosfoglicerato ma senza alcuna produzione di ATP.
Le altre due isoforme della fosfoglicerato mutasi, la fosfoglicerato mutasi 1 o tipo M, presente nel muscolo, e la 2 o tipo B, presente in tutti gli altri tessuti, sono capaci di catalizzare, oltre che l’interconversione del 2-fosfoglicerato e 3-fosfoglicerato, anche i due passaggi dello shunt glicolitico di Rapoport-Luebering, sebbene con efficacia inferiore rispetto alla reazione glicolitica. Dunque sono anch’essi enzimi trifunzionali.

Reazione 9: produzione del fosfoenolpiruvato

Nella nona tappa della via glicolitica si verifica la deidratazione, la rimozione di una molecola di acqua, del 2-fosfoglicerato a dare fosfoenolpiruvato, un enolo. La reazione, reversibile, è catalizzata dalla enolasi.

2-Fosfoglicerato ⇄ Fosfoenolpiruvato + H2O

La reazione richiede la presenza di Mg2+ che va a stabilizzare l’intermedio enolico che si forma nel corso del processo.
Il ΔG°’ della reazione è pari a 1,8 kcal/mol (7,5 kJ/mol), mentre il ΔG è pari a -0,8 kcal/mol (-3,3 kJ/mol).
Come anticipato fosfoenolpiruvato ed 1,3-bisfosfoglicerato sono gli unici due intermedi della glicolisi a possedere un potenziale di trasferimento del gruppo fosforico sufficiente a permettere la sintesi dell’ATP. Da dove deriva l’elevata energia libera standard di idrolisi del gruppo fosforico del fosfoenolpiruvato?
Sebbene fosfoenolpiruvato e 2-fosfoglicerato contengano all’incirca la stessa quantità totale di energia, rispetto alla decomposizione a CO2 e H2O e Pi, la deidratazione del 2-fosfoglicerato porta ad una diversa ridistribuzione della stessa, tale che l’energia libera standard di idrolisi dei due gruppi fosforici corrisponde a:

  • -4,2 kcal/mol (-17,6 kJ/mol) per il 2-fosfoglicerato, un estere fosforico;
  • -14,8 kcal/mol (-61,9 kJ/mol) per il fosfoenolpiruvato, un enol fosfato.

Quello che accade è che il gruppo fosforico del fosfoenolpiruvato intrappola la molecola nella sua forma enolica, instabile. Quando, nell’ultima reazione della via glicolitica, il fosfoenolpiruvato cede il gruppo fosforico all’ADP si formano ATP e la forma enolica del piruvato, instabile, che rapidamente e non enzimaticamente tautomerizza alla più stabile forma chetonica, prevalente a pH 7. Quindi, alla base dell’elevato potenziale di trasferimento del gruppo fosforico del fosfoenolpiruvato c’è la successiva tautomerizzazione enolo-chetone del piruvato.

Reazione 10: produzione di piruvato e ATP

Nell’ultimo passaggio della via glicolitica si verifica il trasferimento del gruppo fosforico dal fosfoenolpiruvato all’ADP con produzione di una molecola di ATP e una di piruvato.

Fosfoenolpiruvato + ADP + H+ → Piruvato + ATP

La reazione, la seconda fosforilazione a livello del substrato della glicolisi, è catalizzata dalla piruvato chinasi, enzima tetramerico la cui attività, al pari della PFK-1, è altamente regolata. Infatti l’enzima possiede siti di legame per numerosi effettori allosterici. Inoltre nei vertebrati sono presenti tre forme isoenzimatiche, di cui una prevalente nel fegato, indicata come forma L, e un’altra, detta forma M, prevalente nel muscolo e nel cervello. I diversi isoenzimi hanno molte proprietà in comune, ma differiscono, oltre che nella distribuzione tissutale, anche nella risposta ad ormoni quali glucagone, epinefrina ed insulina.
L’attività dell’enzima è stimolata dallo ione potassio, K+, e da alcuni altri cationi monovalenti.
La reazione è essenzialmente irreversibile, con un ΔG°’ pari a -7,5 kcal/mol (-31,4 kJ/mol), e un ΔG pari a -4,0 kcal/mol (-16,7 kJ/mol), irreversibilità in gran parte dovuta, come anticipato nel paragrafo precedente, alla rapida tautomerizzazione spontanea del piruvato dalla forma enolica a quella chetonica.

Tautomeri del Piruvato
Fig. 6 – Tautomeri Enolici e Chetonici del Piruvato

E, delle 14,8 kcal/mol (-61,9 kJ/mol) derivanti dall’idrolisi dell’enol fosfato del fosfoenolpiruvato, circa la metà viene conservata grazie alla formazione del legame fosfoanidridico tra Pi e ADP, il cui ΔG°’ di idrolisi è pari a -7,3 kcal/mol (-30,5 kJ/mol). La restante energia, -7,5 kcal/mol (-31,4 kJ/mol), è la forza trainante che spinge la reazione verso la produzione di ATP.
Se, con la reazione catalizzata dalla fosfoglicerato chinasi venivano pareggiate le due molecole di ATP spese nella fase preparatoria della glicolisi, con la reazione catalizzata dalla piruvato chinasi si ha un guadagno netto di due molecole di ATP per molecola di glucosio.

Destino del piruvato e del NADH prodotti nella glicolisi

I prodotti della glicolisi sono tre: ATP, piruvato e NADH.
Il NADH deve essere riossidato a NAD+ per permettere alla glicolisi di procedere.
Il NAD+, un coenzima derivante dalla vitamina niacina, è presente nella cellula in quantità limitata, ≤ 10-5M, valore ben inferiore a quello del glucosio metabolizzato in pochi minuti, e deve essere quindi continuamente rigenerato. E il passaggio finale della via glicolitica è proprio la sua rigenerazione dal NADH attraverso vie metaboliche aerobiche o anaerobiche, ognuna delle quali comporta un ulteriore metabolismo del piruvato, vie che permettono quindi il mantenimento del bilancio redox della cellula.

Glicolisi
Fig. 7 – Destini Catabolici del Piruvato di Origine Glicolitica

Il piruvato è una molecola assai versatile che può entrare in diverse vie metaboliche, sia anaboliche che cataboliche, a seconda del tipo di cellula, dello stato energetico della cellula e della disponibilità di ossigeno. Con l’esclusione di alcune “variazioni” che si incontrano nel mondo dei batteri, sfruttate anche dall’industria alimentare per la produzione di vari alimenti tra cui molti formaggi, sono essenzialmente tre le vie cataboliche che possono essere imboccate dal piruvato:

Questo permette alla glicolisi di procedere sia in condizioni anaerobiche che aerobiche.
E’ quindi anche possibile affermare, ampliando la visuale, che il destino catabolico dello scheletro carbonioso del glucosio è influenzato dal tipo di cellula, dal suo stato energetico e dalla disponibilità di ossigeno.

Fermentazione lattica

Negli animali, con poche eccezioni, ed in molti microrganismi quando la disponibilità di ossigeno non è sufficiente a soddisfare le richieste energetiche della cellula, o se la cellula è priva di mitocondri, il piruvato prodotto dalla glicolisi viene ridotto a lattato nella reazione catalizzata dall’enzima citosolico lattico deidrogenasi (EC 1.1.1.27).

Piruvato + NADH + H+ ⇄ Lattato + NAD+

Nella reazione il NADH fornisce gli equivalenti riducenti e si ossida a NAD+. L’equilibrio complessivo della reazione favorisce fortemente la formazione del lattato, come testimoniato anche del valore del ΔG°’ pari a -6 kcal/mol (-25,1 kJ/mol).
La conversione del glucosio in acido lattico viene definita fermentazione lattica. L’equazione complessiva del processo è:

Glucosio + 2 Pi + 2 ADP + 2 H+ → 2 Lattato + 2 ATP + 2 H2O

Si noti che la fermentazione, scoperta da Louis Pasteur che la definì “la vie sans l’air”, è un processo che:

  • estrae energia dalla molecola del glucosio immagazzinandola in forma di ATP;
  • non consuma ossigeno;
  • non modifica la concentrazione del NAD+ o del NADH.

Riguardo ai coenzimi si noti che nell’equazione complessiva della fermentazione lattica non compaiono ne NAD+ ne NADH, sebbene entrambe cruciali nel processo. Quindi non si verifica alcuna ossidoriduzione netta. In altri termini, nel passaggio da glucosio C6H12O6, a lattato, C3H6O3, il rapporto H:C non varia.
Dal punto di vista energetico va sottolineato che la fermentazione permette di estrarre una ridotta quantità dell’energia chimica contenuta nella molecola del glucosio.

Nell’uomo molto del lattato prodotto entra nel ciclo di Cori, per essere riutilizzato nella gluconeogenesi. In definitiva si può anche affermare che la produzione di lattato sposta parte del carico metabolico dalla periferia, ad esempio dal muscolo scheletrico di un atleta impegnato in un esercizio molto inteso, come uno sprint, quando la velocità della glicolisi può quasi istantaneamente aumentare anche di 2000 volte, al fegato.
Al contrario del muscolo scheletrico che rilascia in circolo lattato, il muscolo cardiaco è in grado di assumere lattato ed utilizzarlo come carburante per produrre ATP, grazie alle proprietà dell’isoenzima cardiaco della lattico deidrogenasi, indicato come H4, e al suo metabolismo completamente aerobico. Quindi, parte del lattato rilasciato dal muscolo scheletrico sottoposto ad un lavoro inteso sarà utilizzato dal muscolo cardiaco come carburante.

Nota: il lattato prodotto dai microorganismi durante la fermentazione lattica è responsabile sia del profumo che del gusto dei crauti, ossia dei cavoli fermentati, come anche del gusto del latte acido.

Fermentazione alcolica

In microorganismi come il lievito di birra e il lievito da panificazione, ma anche in certi tessuti vegetali, e in alcuni invertebrati e protisti, il piruvato, in condizioni ipossiche o anerobiche, può essere ridotto in due passaggi ad alcol etilico o etanolo, con liberazione di CO2.
Il primo passaggio comporta la decarbossilazione non ossidativa del piruvato a dare acetaldeide, una reazione essenzialmente irreversibile. La reazione è catalizzata dalla piruvato decarbossilasi (EC 4.1.1.1), enzima che richiede la presenza di Mg2+ e tiamina pirofosfato, un coenzima derivante dalla vitamina tiamina o vitamina B1. L’enzima è assente nei tessuti dei vertebrati e negli altri organismi che operano la fermentazione lattica.
Nel secondo passaggio si verifica la riduzione dell’acetaldeide ad etanolo nella reazione catalizzata dalla alcol deidrogenasi (EC 1.1.1.1), enzima che ha un atomo di zinco legato nel sito attivo. Nella reazione il NADH fornisce gli equivalenti riducenti e si ossida a NAD+. A pH neutro, l’equilibrio della reazione è fortemente spostato verso la formazione dell’alcol etilico.
La conversione del glucosio in etanolo e CO2 viene definita fermentazione alcolica. La reazione complessiva è:

Glucosio + 2 Pi + 2 ADP + 2 H+ → 2 Etanolo + 2 CO2 + 2 ATP + 2 H2O

E, al pari della fermentazione lattica, anche nella fermentazione alcolica non si verifica alcuna ossido-riduzione netta.

La fermentazione alcolica è alla base della produzione della birra  e del vino. Da notare che la CO2 prodotta dal lievito di birra è responsabile delle caratteristiche bollicine della birra, dello champagne e dello spumante, mentre quella prodotta dal lievito usato nella panificazione porta alla lievitazione dell’impasto.

Destino del piruvato e del NADH in condizioni aerobiche

Nelle cellule dotate di mitocondri e in condizioni aerobiche, la situazione più comune negli organismi multicellulari e in molti unicellulari, l’ossidazione del NADH ed il catabolismo del piruvato seguono vie distinte.
Il piruvato viene dapprima convertito in acetil-CoA nelle reazioni catalizzate dal complesso della piruvato deidrogenasi, un  complesso multienzimatico mitocondriale. Nella reazione, una decarbossilazione ossidativa, la molecola perde un atomo di carbonio in forma di CO2, e l’unità a due atomi di carbonio rimanente è legata al coenzima A a dare acetil-coenzima A o semplicemente acetil-CoA.

Piruvato + NAD+ + CoA → Acetil-CoA + CO2 + NADH + H+

Il gruppo acetilico dell’acetil-CoA è quindi completamente ossidato a CO2 attraverso le reazioni del ciclo dell’acido citrico, con produzione di ulteriore NADH, ed anche di FADH2. Il complesso della piruvato deidrogenasi rappresenta quindi un ponte tra la glicolisi, che si verifica nel citosol, e il ciclo dell’acido citrico, una via metabolica mitocondriale.
Gli elettroni derivati dalle ossidazioni che si verificano durante la glicolisi sono trasportati nel mitocondrio a seguito della riduzione di intermedi metabolici citosolici. In questo modo nel citosol viene rigenerato NAD+ dal NADH, mentre l’intermedio ridotto, una volta nella matrice mitocondriale, è riossidato grazie al trasferimento dei suoi equivalenti riducenti al Complesso I della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale. In questa sede gli elettroni passano all’ossigeno a dare H2O, trasferimento che fornisce l’energia necessaria per la sintesi dell’ATP attraverso il processo della fosforilazione ossidativa. Ovviamente anche gli elettroni trasportati dal NADH prodotto nelle reazioni catalizzate dal complesso della piruvato deidrogenasi e nel ciclo dell’acido citrico, e quelli del FADH2, seguono un analogo destino.
Nota: il FADH2 cede i suoi equivalenti riducenti non al Complesso I ma al Complesso II.

Destino anabolico del piruvato

In condizioni anaboliche lo scheletro carbonioso del piruvato può avere destini diversi dalla completa ossidazione a CO2, o dalla conversione in lattato. Infatti, previa conversione in acetil-CoA, potrà essere utilizzato ad esempio per la sintesi degli acidi grassi, o dell’aminoacido alanina (vedi Fig. 3).

Glicolisi e produzione di ATP

Nella via glicolitica una molecola di glucosio viene convertita in due di piruvato.
Nella prima fase, la fase preparatoria, sono consumate due molecole di ATP nelle reazioni catalizzate dalla esochinasi e dalla PFK-1. Nella seconda fase, la fase di recupero energetico, sono prodotte 4 molecole di ATP attraverso fosforilazioni a livello del substrato nelle reazioni catalizzate dalla fosfoglicerato chinasi e dalla piruvato chinasi. Quindi si ha un guadagno netto di due molecole di ATP per molecola di glucosio metabolizzata. In più, nella reazione catalizzata dalla gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi, per ogni molecola di glucosio sono prodotte due molecole di NADH.

Glicolisi
Fig. 8 – Variazioni dell’Energia Libera delle Reazioni della Via Glicolitica

Il ΔG°’ dell’intero processo è pari a -20,3 kcal/mol (-85 kJ/mol), valore che deriva dalla differenza tra il ΔG°’ della conversione del glucosio in due molecole di piruvato, pari a -34,9 kcal/mol (146 kJ/mol), e il ΔG°’ della formazione dell’ATP da ADP e Pi, pari a 2 x 7,3 kcal/mol = 14,6 kcal/mol (2 x 30,5 kJ/mol = 61 kJ/mol). Di seguito le due reazioni.

Glucosio + 2 NAD+ → 2 Piruvato + 2 NADH + 2 H+

2 ADP + 2 Pi → 2 ATP + 2 H2O

La somma delle due reazioni da la reazione complessiva della glicolisi.

Glucosio + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi → 2 Piruvato + 2 NADH + 2 H+ + 2 ATP + 2 H20

Dunque, in condizioni standard, la quantità di energia libera rilasciata che viene immagazzinata nell’ATP corrisponde a: (14,6/34,9) x 100 = 41,8 % .

Nota: l’equazione complessiva della glicolisi può anche essere derivata considerando tutti i reagenti in ingresso ed i prodotti.

Glucosio + 2 ATP + 2 NAD+ + 4 ADP + 2 Pi → 2 Piruvato + 2 ADP + 2 NADH + 2 H+ + 4 ATP + 2 H20

Eliminando i termini comuni si ottiene l’equazione complessiva mostrata sopra.

Glicolisi e produzione di ATP in condizioni anaerobiche

In condizioni anaerobiche, a prescindere da quello che sarà il destino metabolico del piruvato, conversione in lattato, etanolo o altre molecole, non sono prodotte altre molecole di ATP a valle della glicolisi.
Quindi in queste condizioni la glicolisi permette di estrarre solamente una frazione dell’energia chimica contenuta nella molecola del glucosio, pari a 679 kcal/mol (2840 kJ/mol) rilasciate a seguito della sua ossidazione a CO2 e H20. Infatti, la conversione del glucosio in due molecole di piruvato porta al rilascio di 34,9 kcal/mol, il che significa che solamente il 5%, [(34,9/679) x 100], dell’energia chimica contenuta nella molecola del glucosio è rilascia a seguito della sua conversione in piruvato. Quindi il piruvato contiene ancora la maggior parte dell’energia chimica del glucosio.
Analogamente, neppure i 4 elettroni, in forma di ioni idruro, trasportati dalle due molecole di NADH potranno essere utilizzati per la produzione di ATP.
Considerando la fermentazione lattica, il ΔG°’ associato alla conversione di una molecola di glucosio in due di lattosio è pari a -43,9 kcal/mol (-183,6 kJ/mol) e la percentuale dell’energia libera rilasciata ed immagazzinata in forma di ATP sarà pari a: (14,6/43,9) x 100 = 33,2%, mentre se si considera la sola glicolisi la percentuale è del 41,8%. Da notare che nelle condizioni intracellulari la quantità di energia libera necessaria per la sintesi dell’ATP da ADP e Pi è molto più elevata di quella in condizioni standard, per cui la percentuale dell’energia libera disponibile immagazzinata è maggiore, pari a circa il 50% del totale.

Glicolisi e produzione di ATP in condizioni aerobiche

In condizioni aerobiche, nelle cellule dotate di mitocondri, la quantità di energia chimica che può essere estratta dalla molecola del glucosio ed immagazzinata in forma di ATP è molto maggiore rispetto a quanto accade in assenza di ossigeno.
Se si considerano solo le due molecole di NADH prodotte durante la glicolisi, il trasferimento dei loro 4 equivalenti riducenti lungo la catena di trasporto degli elettroni mitocondriale permette la produzione di 2-3 molecole di ATP per coppia di elettroni attraverso la fosforilazione ossidativa. In questo caso si avrà una produzione netta di ATP compresa tra 6 ed 8 molecole per ogni molecola di glucosio ossidata a due di piruvato, dalla glicolisi e 4-6 dalla fosforilazione ossidativa.

Nota: la quantità complessiva di ATP prodotta dagli equivalenti riducenti del NADH dipende dal sistema attraverso cui gli equivalenti riducenti del coenzima ridotto entrano nel mitocondrio.

Se invece si analizza l’azione concertata della glicolisi, del complesso della piruvato deidrogenasi, del ciclo dell’acido citrico, della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale e della fosforilazione ossidativa, viene estratta ed immagazzinata in forma di ATP molta altra dell’energia chimica disponibile presente nel monosaccaride. In questo caso, secondo quanto riportato dal Lehninger sono prodotti 30-32 ATP/molecola di glucosio, sebbene recenti stime suggeriscano una produzione netta pari a 29,85 ATP/molecola di glucosio, o 29,38 ATP/molecola di glucosio se anche l’ATP derivato dal GTP, prodotto dal ciclo dell’acido citrico, viene esportato. Considerando entrambe le stime, la produzione di ATP è circa 15 volte maggiore rispetto a quanto accade in assenza di ossigeno.

Vie di alimentazione della glicolisi

Oltre al glucosio, altri carboidrati, sia semplici che complessi, possono essere catabolizzati attraverso la glicolisi, previa conversione enzimatica in uno degli intermedi della via metabolica stessa.
Tra i più importanti si ritrovano:

Glicolisi
Fig. 9 – Vie di Alimentazione della Glicolisi

L’amido ed i disaccaridi assunti con l’alimentazione debbono essere idrolizzati a livello intestinale nei rispettivi monosaccaridi prima essere assorbiti. Una volta nel circolo venoso raggiungono attraverso la vena porta il fegato, ed è principalmente in questa sede che sono metabolizzati.

Glicogeno ed amido

Per quanto riguarda il catabolismo fosforolitico dell’amido e del glicogeno endogeno si rimanda ai rispettivi articoli.

Fruttosio

In condizioni fisiologiche, il fegato rimuove dal circolo ematico molto del fruttosio ingerito, prima che lo stesso possa raggiungere i tessuti extraepatici.
La via metabolica epatica che porta alla conversione del monosaccaride in intermedi della glicolisi si compone di alcuni passaggi.
Nel primo il fruttosio viene fosforilato a fruttosio-1-fosfato nella reazione catalizzata dalla fruttochinasi (EC 2.7.1.4), con consumo di una molecola di ATP (vedi Fig. 9).

Fruttosio + ATP → Fruttosio-1-fosfato + ADP + H+

La reazione richiede la presenza di ioni magnesio.
Come per il glucosio, anche per il fruttosio la fosforilazione ha come effetto quello di intrappolare la molecola all’interno della cellula.
Nel secondo passaggio il fruttosio-1-fosfato viene scisso a diidrossiacetone fosfato e gliceraldeide, nella reazione catalizzata dalla fruttosio-1-fosfato aldolasi.

Fruttosio-1-fosfato→ Diidrossiacetone Fosfato + Gliceraldeide

Il diidrossiacetone fosfato è un intermedio della glicolisi e prosegue lungo la via previa conversione in gliceraldeide-3-fosfato. Invece, la gliceraldeide, che non è un intermedio della via glicolitica, viene fosforilata a gliceraldeide-3-fosfato nella reazione catalizzata dalla trioso chinasi (EC 2.7.1.28), con consumo di una seconda molecola di ATP.

Gliceraldeide + ATP → Gliceraldeide-3-fosfato + ADP + H+

La reazione richiede la presenza di ioni Mg2+.
Quindi nell’epatocita, una molecola di fruttosio viene convertita in due di gliceraldeide-3-fosfato, con consumo di due molecole di ATP, come per il glucosio.

Fruttosio + 2 ATP → 2 Gliceraldeide-3-fosfato +2 ADP +2 H+

Fruttosio ed esochinasi

In sedi extraepatiche come il muscolo scheletrico, il rene o il tessuto adiposo non è presente la fruttochinasi, ed il fruttosio entra nella via glicolitica in forma di fruttosio-6-fosfato (vedi Fig. 9). Infatti tra i substrati della esochinasi c’è anche il fruttosio, che viene fosforilato in posizione C-6.

Fruttosio + ATP → Fruttosio-6-fosfato + ADP + H+

L’affinità dell’enzima per il fruttosio è però circa 20 volte minore rispetto a quella per il glucosio, per cui nell’epatocita, dove il glucosio è molto più abbondante del fruttosio, o nel muscolo scheletrico in condizioni di scarsa disponibilità di ossigeno, quando cioè il glucosio diviene il carburante preferito, si forma poco fruttosio-6-fosfato. Al contrario, nel tessuto adiposo il fruttosio è più abbondante del glucosio per cui la sua fosforilazione ad opera della esochinasi non è inibita competitivamente in modo significativo dal glucosio. In questo tessuto quindi la sintesi del fruttosio-6-fosfato rappresenta il modo principale per incanalare il monosaccaride nella via glicolitica.
Ai fini degli effetti metabolici del fruttosio è importante sottolineare che nel fegato il monosaccaride, essendo fosforilato in posizione C-1, entra nella glicolisi a livello dei trioso fosfati, dunque a valle della reazione catalizzata dalla PFK-1, enzima che gioca un ruolo chiave nella regolazione del flusso del carbonio attraverso la glicolisi stessa. Al contrario, quando il monosaccaride viene fosforilato sul C-6, entra nella via glicolitica a monte della reazione catalizzata dalla PFK-1.

Sorbitolo

Il fruttosio rappresenta il punto d’ingresso nella via glicolitica anche per il sorbitolo (vedi Fig. 9). La molecola, presente in molti frutti e vegetali ed utilizzata anche come dolcificante e stabilizzante, nel fegato è convertita in fruttosio nella reazione catalizzata dall’enzima citosolico sorbitolo deidrogenasi (EC 1.1.99.21).

Sorbitolo + NAD+ → Fruttosio + NADH + H+

La reazione richiede la presenza di ioni Zn2+.

Galattosio

Il galattosio, che per la maggior parte deriva dalla digestione intestinale del lattosio, raggiunto il fegato viene convertito, attraverso la via di Leloir, in glucosio-1-fosfato.
Per una trattazione più approfondita della via di Leloir si rimanda all’articolo sul galattosio.
Il destino del glucosio-1-fosfato dipende dallo stato energetico della cellula.
In condizioni che favoriscono il deposito di glucosio, la molecola può essere incanalata nella via di sintesi del glicogeno.
In condizioni che favoriscono l’utilizzo del glucosio per la produzione di energia, il glucosio-1-fosfato viene isomerizzato in glucosio-6-fosfato nella reazione reversibile catalizzata dalla fosfoglucomutasi (EC 5.4.2.2).

Glucosio-1-fosfato ⇄ Glucosio-6-fosfato

A sua volta il glucosio-6-fosfato prodotto potrà essere incanalato nella via glicolitica per essere utilizzato per la produzione di energia (vedi Fig. 9), o essere defosforilato a glucosio nella reazione catalizzata dal complesso proteico della glucosio-6-fosfatasi ed essere quindi rilasciato nel circolo ematico.

Mannosio

Il mannosio è presente in vari polisaccaridi, glicolipidi e glicoproteine della dieta. Una volta liberato da queste fonti, viene assorbito, e raggiunto il fegato è fosforilato in posizione C-6 a dare mannosio-6-fosfato, nella reazione catalizzata dalla esochinasi (vedi Fig. 9).

Mannosio + ATP → Mannosio-6-fosfato + ADP + H+

Il mannosio-6-fosfato è quindi isomerizzato a fruttosio-6-fosfato nella reazione catalizzata dalla mannosio-6-fosfato isomerasi (EC 5.3.1.8.).

Mannosio-6-fosfato ⇄ Fruttosio-6-fosfato

Regolazione della glicolisi

Il flusso di carbonio attraverso la via glicolitica viene regolato in base alle condizioni metaboliche all’interno e all’esterno della cellula, rispondendo essenzialmente a due bisogni: la produzione di ATP e la produzione di precursori per molte vie biosintetiche.
Inoltre, nel fegato, per evitare uno spreco di energia, glicolisi e gluconeogenesi sono finemente regolate in modo che quando una via procede l’altra rallenta. Come spiegato nell’articolo sulla gluconeogenesi, nel corso dell’evoluzione ciò è stato ottenuto selezionando enzimi differenti per catalizzare le reazioni essenzialmente irreversibili delle due vie, enzimi la cui attività è regolata separatamente. Se infatti queste reazioni procedessero simultaneamente ad elevata velocità creerebbero un ciclo futile o ciclo del substrato. Una regolazione così fine non potrebbe essere ottenuta se uno stesso enzima catalizzasse la reazione nelle due direzioni.
Il controllo del flusso di carbonio attraverso la glicolisi coinvolge principalmente le reazioni catalizzate dagli enzimi esochinasi, PFK-1 e piruvato chinasi, la cui attività è regolata mediante:

  • meccanismi allosterici, che si svolgono in un arco temporale di millisecondi e sono istantaneamente reversibili;
  • modificazioni covalenti, ossia fosforilazioni e defosforilazioni, che si svolgono in secondi;
  • modificazioni nella concentrazione degli enzimi coinvolti, conseguenti a modifiche nella loro velocità di sintesi/degradazione, che avvengono in ore.

Nota: per la gluconeogenesi i principali punti di regolazione sono le reazioni catalizzate dagli enzimi piruvato carbossilasi (EC 6.4.1.1) e fruttosio-1,6-bisfosfatasi (EC 3.1.3.11).

Esochinasi

Nell’uomo la esochinasi è presente con quattro forme isoenzimatiche tessuto specifiche, designate da I a IV, e codificate da altrettanti geni differenti.
La esochinasi I è l’isoenzima prevalente nel cervello, mentre nel muscolo scheletrico si ritrova sia l’esochinasi I, che costituisce il 70-75% del totale, che la esochinasi II, che rappresenta il restante 25-30%.
L’esochinasi IV, detta anche glucochinasi (EC 2.7.1.2) è presente prevalentemente negli epatociti e nelle cellule β del pancreas, dove è il principale isoenzima. Nel fegato, con la glucosio-6-fosfatasi, catalizza il ciclo del substrato tra glucosio e glucosio-6-fosfato.
La glucochinasi differisce dalle altre isoforme della esochinasi per quanto riguarda la cinetica e le proprietà regolatorie.

Nota: gli isoenzimi o isozimi sono proteine differenti che catalizzano la stessa reazione, e che in genere si differenziano per le proprietà cinetiche e regolatorie, distribuzione subcellulare, o per i cofattori utilizzati. Possono essere presenti contemporaneamente in una stessa specie, tessuto o anche cellula.

Proprietà cinetiche delle esochinasi

Le esochinasi I, II e III hanno proprietà cinetiche simili.
La esochinasi I e la II hanno una Km per il glucosio, ossia la concentrazione del glucosio alla quale l’enzima è per metà saturato, rispettivamente pari a 0,03 mM e 0,1 mM. Pertanto questi due isoenzimi lavorano in modo molto efficiente ai normali valori di glicemia, che sono pari a circa 4-5 mM.
Invece la glucochinasi ha una Km per il glucosio assai più alta, pari a circa 10 mM; questo significa che l’attività dell’enzima diviene importante solo quando i valori della glicemia sono alti, come dopo un pasto ricco di carboidrati ad alto indice glicemico.

Regolazione delle esochinasi I-III

Le esochinasi I-III sono inibite allostericamente dal glucosio-6-fosfato, il prodotto della loro reazione. Questo assicura che il glucosio-6-fosfato non si accumuli nella cellula quando non è richiesto ulteriore glucosio per la produzione di energia, la sintesi del glicogeno, la via del pentoso fosfato, o come fonte di intermedi per la sintesi di altre molecole, e al contempo permette di ridurre l’assunzione dal circolo di altro glucosio che rimane quindi disponibile per altri organi e tessuti. Ad esempio, quando la PFK-1 è inibita, si accumula fruttosio-6-fosfato e, grazie alla reazione catalizzata dalla fosfoglucosio isomerasi, glucosio-6-fosfato. Dunque, l’inibizione della PFK-1 porta alla inibizione delle esochinasi I-III.

Nel muscolo scheletrico l’attività della esochinasi I e II è coordinata con quella di GLUT4, un trasportatore del glucosio con una bassa Km per il monosaccaride (5 mM), la cui traslocazione sulla membrana plasmatica è indotta sia dall’insulina che dall’attività fisica. L’azione combinata delle esochinasi e di GLUT4 mantiene un equilibrio tra l’ingresso del glucosio nella cellula e la sua fosforilazione. Considerando che la concentrazione ematica del monosaccaride è compresa tra 4 e 5 mmol/L, il suo ingresso nel miocita per mezzo di GLUT4 può portare la sua concentrazione a valori sufficientemente elevati da saturare o quasi l’enzima, che dunque può lavora vicino o addirittura alla sua Vmax.

Regolazione della glucochinasi epatica

La glucochinasi differisce per almeno tre aspetti dalle esochinasi I-III, ed è particolarmente idonea per il ruolo che il fegato svolge nel controllo della glicemia. Perché?

  • Come detto in precedenza, la glucochinasi ha una Km per il glucosio pari a circa 10 mM, molto più elevata rispetto alla Km per il glucosio delle esochinasi I-III, e più alta anche del valore della glicemia a digiuno, pari a circa 4-5 mM. Nel fegato, dove rappresenta l’isoenzima prevalente, il suo ruolo è quello di fornire glucosio-6-fosfato per la sintesi del glicogeno e degli acidi grassi. L’enzima lavora in modo coordinato con il trasportatore del glucosio GLUT2, il principale carrier per il glucosio nell’epatocita, la cui Km per lo zucchero è circa 10 mM. Quindi GLUT2 è molto attivo quando la glicemia è elevata, equilibrando rapidamente la concentrazione del glucosio nel citosol dell’epatocita con quella presente nel sangue. In queste condizioni la glucochinasi è attiva e catalizza la conversione del glucosio in glucosio-6-fosfato, e, grazie alla elevata Km per il glucosio la sua attività continua ad aumentare anche quando la concentrazione intracellulare dello zucchero raggiunge o supera le 10 mM. Quindi la velocità con cui il monosaccaride entra nella cellula e di seguito viene fosforilato è determinata dal valore della stessa glicemia.
    Quando invece la disponibilità del glucosio è scarsa, la sua concentrazione nel citosol dell’epatocita è altrettanto bassa, ben più bassa del valore della Km della glucochinasi, per cui il glucosio prodotto attraverso la gluconeogenesi e/o la glicogenolisi non viene fosforilato e può lasciare la cellula.
    Una situazione simile si verifica anche nelle cellule β del pancreas, dove il sistema GLUT2/glucochinasi fa si che la concentrazione intracellulare del glucosio-6-fosfato equipari quella del glucosio nel sangue, permettendo alla cellula di rilevare e rispondere ad elevate glicemie.
  • A differenza delle esochinasi I-III, la glucochinasi non è inibita dal glucosio-6-fosfato, per cui continua a catalizzarne la sintesi anche quando questi si accumula.
  • La glucochinasi viene inibita a seguito del legame reversibile ad una specifica proteina regolatrice detta anche GKRP, acronimo dell’inglese glucokinase regulatory protein. Il meccanismo con cui la proteina regolatrice agisce implica l’ancoraggio della glucochinasi all’interno del nucleo, dove rimane separata dagli altri enzimi della glicolisi.
    Glicolisi
    Fig. 10 – Regolazione della Glucochinasi Epatica

    Il legame tra glucochinasi e GKRP è molto più forte in presenza del fruttosio-6-fosfato mentre è indebolito dal glucosio e dal fruttosio-1-fosfato.
    In assenza di glucosio la glucochinasi si trova nella sua conformazione “super-aperta” che è dotata di bassa attività. L’aumento nei livelli citosolici di glucosio determina una transizione concentrazione-dipendente dell’enzima verso la sua conformazione chiusa, la conformazione attiva che non è accessibile alla GKRP. Ne consegue che la glucochinasi è attiva e non più inibita.
    Da notare che il fruttosio-1-fosfato è presente nell’epatocita solamente quando viene metabolizzato il fruttosio, che quindi, quando disponibile fa venire meno l’inibizione della glucochinasi da parte di GKRP.
    Esempio.
    Quando dopo un pasto ricco di carboidrati la glicemia sale, il glucosio tramite il GLUT2 entra nella cellula epatica, e quindi attraverso i pori nucleari nel suo nucleo dove determina la transizione della glucochinasi verso la sua conformazione chiusa, attiva e non accessibile a GKRP, permettendo così all’enzima di diffondere nel citosol dove potrà fosforilare il glucosio.
    Viceversa, quando il glucosio è scarso, come nel digiuno quando la glicemia può scendere sotto il valore di 4 mM, la concentrazione del glucosio nell’epatocita è bassa, ed il fruttosio-6-fosfato associandosi a GKRP permette a quest’ultima di legarsi in modo più saldo alla glucochinasi. Da ciò ne risulta una inibizione molto efficace dell’enzima. Questo concorre ad evitare che il fegato, in condizioni di bassa glicemia, competa con gli altri organi, in primis il cervello, per il poco glucosio disponibile.
    Nella cellula il fruttosio-6-fosfato è presente in equilibrio con il glucosio-6-fosfato grazie alla reversibilità della reazione catalizzata dalla fosfoglucosio isomerasi. Tramite la sua associazione con GKRP, il fruttosio-6-fosfato opera quindi un feedback negativo segnalando alla cellula che non è necessario produrre altro glucosio-6-fosfato, ossia che l’attività della glucochinasi può ridursi per prevenire l’accumulo di intermedi.

Riassumendo si può dire che quando i valori della glicemia sono normali, il glucosio viene fosforilato prevalentemente ad opera delle esochinasi I-III, mentre quando la glicemia è elevata l’esoso è fosforilato ad opera della glucochinasi.

Regolazione della fosfofruttochinasi-1

La fosfofruttochinasi-1 è il principale punto di controllo del flusso di carbonio attraverso la via glicolitica.
L’enzima, oltre ai siti di legame per i substrati, presenta molti altri siti su cui vanno a legarsi effettori allosterici sia inibitori che attivatori.
Tra gli effettori allosterici negativi si ha l’ATP, che è anche un substrato dell’enzima ed un prodotto finale della glicolisi, il citrato e gli ioni idrogeno.
Tra gli effettori allosterici positivi si ritrovano l’AMP, il Pi ed il fruttosio-2,6-bisfosfato.

Glicolisi
Fig. 11- Regolazione della PFK-1 e della Fruttosio-1,6-bisfosfatasi

Nota: la PFK-1 presenta due siti di legame distinti per l’ATP, uno nel sito attivo e dotato di grande affinità per la molecola, e l’altro, regolatorio, a bassa affinità.
Che cosa segnalano i diversi effettori allosterici?

  • ATP, AMP e Pi segnalano lo stato energetico della cellula.
    L’attività della fosfofruttochinasi-1 aumenta quando la cellula necessita di energia, ossia quando c’è necessità di ATP, mentre si riduce quando lo stato energetico della cellula è alto, ossia quando la cellula è ricca di ATP. In che modo?
    Quando la concentrazione di ATP è elevata, quando cioè il nucleotide viene prodotto ad una velocità superiore a quella con cui è consumato, lo stesso legandosi allo specifico sito allosterico va ad inibire la fosfofruttochinasi-1, riducendone l’affinità per il fruttosio-6-fosfato. Dal punto di vista cinetico l’aumento della concentrazione dell’ATP determina una cambiamento della rapporto tra la velocità di reazione e la concentrazione del fruttosio-6-fosfato che diviene sigmoide da iperbolico, e quindi si ha un aumento della Km dell’enzima per il fruttosio-6-fosfato stesso. Tuttavia nella maggior parte delle condizioni cellulari la concentrazione dell’ATP non varia più di tanto. Ad esempio, nel muscolo durante un esercizio vigoroso si possono avere riduzioni della concentrazione di ATP di circa un 10% rispetto alla situazione di riposo mentre la velocità della glicolisi varia molto di più rispetto a quanto ci si aspetterebbe da tale riduzione.
    Quando la velocità di produzione dell’ATP è inferiore a quella con cui viene consumato, si verifica l’aumento della concentrazione dell’AMP e dell’ADP, e in particolare dell’AMP, grazie all’azione dell’enzima adenilato chinasi (EC 2.7.4.3 ), secondo la reazione di seguito descritta.

ADP + ADP ⇄ ATP + AMP

La costante di equilibrio Keq della reazione è:

Keq = [ATP][AMP]/[ADP]2= 0,44

Nelle normali condizioni cellulari la concentrazione dell’ADP e dell’AMP corrispondono rispettivamente a circa il 10% e a meno dell’1% di quella dell’ATP. Pertanto, considerando che il pool dell’adenilato è costante nel breve periodo, anche una piccola variazione nella concentrazione dell’ATP porterà, grazie all’attività della adenilato chinasi, ad una variazione relativa molto maggiore della concentrazione dell’AMP. A sua volta l’AMP agisce rimuovendo l’inibizione dovuta all’ATP.
Quindi, l’attività della fosfofruttochinasi-1 dipende dallo stato energetico della cellula:

quando l’ATP è abbondante l’attività dell’enzima si riduce;

quando i livelli di AMP aumentano l’attività dell’enzima aumenta.

Perché l’ADP non è un effettore allosterico positivo della fosfofruttochinasi-1? Ci sono due ragioni.
Quando la carica energetica della cellula si riduce, l’ADP è utilizzato per riformare l’ATP, nella reazione catalizzata dalla adenilato chinasi. Inoltre, come detto in precedenza, una piccola riduzione nei livelli di ATP porta una più elevata variazione percentuale nei livelli dell’ADP e soprattutto dell’AMP.

  • Gli ioni idrogeno inibiscono la fosfofruttochinasi-1. Tale inibizione previene, controllando la velocità della glicolisi, l’eccessivo accumulo di lattato e la conseguente caduta del pH ematico.
  • Il citrato è un inibitore allosterico della fosfofruttochinasi-1 che agisce aumentando l’effetto inibitorio dell’ATP.
    Il citrato è il prodotto del primo passaggio del ciclo dell’acido citrico, una via metabolica che fornisce intermedi metabolici per le vie biosintetiche e indirizza gli elettroni verso la catena di trasporto degli elettroni mitocondriale per la sintesi dell’ATP via fosforilazione ossidativa. Elevati livelli citosolici di citrato indicano che nel mitocondrio si sta verificando la produzione di un eccesso di precursori e che le richieste energetiche della cellula sono state soddisfatte, ossia, il ciclo dell’acido citrico ha raggiunto la saturazione; pertanto la glicolisi, che rifornisce il ciclo in condizioni aerobiche, può rallentare, risparmiando glucosio.
    Quindi, va sottolineato che la PFK-1 accoppia la glicolisi ed il ciclo dell’acido citrico.
  • Nel fegato il punto centrale per la regolazione sia della glicolisi che della gluconeogenesi è rappresentato dal ciclo del substrato tra fruttosio-6-fosfato e fruttosio-1,6-bisfosfato, catalizzato dagli enzimi fosfofruttochinasi-1 e fruttosio-1,6-bisfosfatasi.
    Il fegato gioca un ruolo cruciale nel mantenimento della glicemia entro valori normali.
    Se la glicemia scende, il glucagone a livello epatico stimola la sintesi, via glicogenolisi e gluconeogenesi, di glucosio, e al contempo segnala all’organo di non consumare l’esoso per soddisfare i propri fabbisogni.
    Quando invece la glicemia è elevata, l’insulina induce il fegato ad utilizzare il glucosio per produrre energia, sintetizzare glicogeno e trigliceridi.
    In quest’ottica, la regolazione della glicolisi e della gluconeogenesi è mediata dal fruttosio-2,6-bisfosfato, una molecola che permette all’organo di svolgere un ruolo di primo piano nella regolazione della glicemia segnalando il rapporto tra insulina e glucagone.
    A seguito del legame allo specifico sito allosterico sulla fosfofruttochinasi-1, il fruttosio-2,6-bisfosfato aumenta l’affinità dell’enzima per il fruttosio-6-fosfato, il suo substrato, mentre diminuisce quella per gli inibitori allosterici citrato e ATP. Ed è notevole sottolineare che in presenza di concentrazioni fisiologiche dei substrati e degli effettori allosterici sia positivi che negativi l’enzima, in assenza di fruttosio-2,6-bisfosfato, è praticamente inattivo.
    Viceversa, il legame del fruttosio-2,6-bisfosfato alla fruttosio-1,6-bisfosfatasi ne comporta l’inibizione, anche in assenza di AMP, un altro inibitore allosterico dell’enzima.
    Grazie a queste azioni la molecola aumenta il flusso netto di glucosio attraverso la glicolisi.
    Per la trattazione approfondita del metabolismo del fruttosio-2,6-bisfosfato si rimanda all’articolo sulla gluconeogenesi.
  • Altro metabolita importante per il controllo del flusso del carbonio attraverso la glicolisi e la gluconeogenesi è lo xilulosio-5-fosfato, un intermedio della via del pentoso fosfato, la cui concentrazione nell’epatocita aumenta a seguito dell’ingestione di un pasto ricco di carboidrati. La molecola, attivando la protein fosfatasi 2A porta infine ad un aumento della concentrazione del fruttosio-2,6-bisfosfato e quindi ad un incremento del flusso del carbonio attraverso la glicolisi e alla riduzione di quello attraverso la gluconeogenesi.

Regolazione della piruvato chinasi

Un ulteriore punto di regolazione del flusso di carbonio attraverso la glicolisi e la gluconeogenesi è rappresentato dal ciclo del substrato tra il fosfoenolpiruvato ed il piruvato, catalizzato dalla piruvato chinasi, per la glicolisi, e dall’azione combinata della piruvato carbossilasi e della fosfoenolpiruvato carbossichinasi (EC 4.1.1.32) per la gluconeogenesi.
Tutte le isoforme della piruvato chinasi sono allostericamente inibite da elevate concentrazioni di ATP, acetil-CoA e acidi grassi a catena lunga, segnali che la cellula si trova in uno stato energetico ottimale. Anche l’alanina, che può essere sintetizzata dal piruvato attraverso una reazione di transaminazione, è un inibitore allosterico dell’enzima; il suo accumulo segnala l’abbondanza di precursori per le vie biosintetiche.

Glicolisi
Fig. 12 – Regolazione della Piruvato Chinasi Epatica

Di contro la piruvato chinasi è allostericamente attivata dal fruttosio-1,6-bisfosfato, il prodotto della prima reazione esclusiva della glicolisi, il che permette all’enzima di tenere il passo con il flusso di intermedi in arrivo. E va sottolineato il fatto che, in una situazione di concentrazioni fisiologiche di substrato, ossia il fosfoenolpiruvato, e degli inibitori ATP ed alanina, la piruvato chinasi sarebbe completamente inibita senza l’effetto stimolatorio del fruttosio-1,6-bisfosfato.
L’isoenzima epatico, ma non quello muscolare, è soggetto anche a regolazione attraverso fosforilazione ad opera della:

  • protein chinasi A, attivata a seguito del legame del glucagone allo specifico recettore o dell’epinefrina ai recettori β-adrenergici;
  • protein chinasi calcio/calmodulina dipendente, attivata dal legame dell’epinefrina ai recettori α1-adrenergici.

La fosforilazione dell’enzima ne riduce l’attività a seguito di un aumento della sua Km per il fosfoenolpiruvato, e rallenta la glicolisi.
Ad esempio, a seguito di una riduzione della glicemia, la fosforilazione indotta dal glucagone riduce l’attività dell’enzima. Nella forma fosforilata l’enzima è anche meno facilmente stimolato dal fruttosio-1,6-bisfosfato ma più facilmente inibito dall’alanina e dall’ATP. Di contro, l’enzima in forma defosforilata è più sensibile al fruttosio-1,6-bisfosfato, e meno agli inibitori allosterici ATP ed alanina. In questo modo quando la glicemia è bassa, il fegato rallenta l’ossidazione del glucosio a scopi energetici, e lo zucchero rimane quindi disponibile per altri tessuti ed organi, come il cervello. Va comunque notato che la piruvato chinasi non subisce la fosforilazione indotta dal glucagone in presenza del fruttosio 1,6-bisfosfato.
Di contro, un aumento nel rapporto insulina/glucagone porta infine alla defosforilazione dell’enzima e quindi alla sua attivazione. Nella forma defosforilata l’enzima è meno sensibile agli inibitori allosterici alanina ed ATP, ma più sensibile al suo attivatore allosterico, il fruttosio-1,6-bisfosfato.

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