Convenzione di Fischer-Rosanoff

Nel 1906, il chimico russo-americano Martin André Rosanoff, allora alla New York University, scelse la gliceraldeide, un monosaccaride, come standard per descrivere la stereochimica dei carboidrati e di altre molecole con almeno un centro di chiralità, un sistema di nomenclatura noto come convenzione di Fischer-Rosanoff, o convenzione di Rosanoff, o sistema D-L.
Non conoscendo la configurazione assoluta della gliceraldeide, Rosanoff assegnò in modo del tutto arbitrario:

  • la lettera D, dal latino dexter che significa “destra”, alla (+)-gliceraldeide, l’enantiomero destrorotatorio, ipotizzando che la configurazione, nelle proiezioni di Fischer, fosse quella con il gruppo idrossilico (–OH) legato al centro chirale disposto sul lato destro della molecola;
  • la lettera L, dal latino laevus che significa “sinistra”, alla (-)-gliceraldeide, l’enantiomero levorotatorio, ipotizzando che la configurazione, nelle proiezioni di Fischer, fosse quella con il gruppo idrossilico legato al centro chirale disposto sul lato sinistro della molecola.
    Convenzione di Fischer-Rosanoff: D-gliceraldeide ed L-gliceraldeide come standard per la stereochimica delle molecole chirali

E, sebbene Fischer lo respinse, questo sistema di nomenclatura fu universalmente accettato ed utilizzato per derivare le configurazioni relative delle molecole chirali. In che modo? La configurazione attorno ad un centro chirale viene messa in relazione con quella della gliceraldeide convertendo i gruppi della molecola in esame in quelli del monosaccaride attraverso reazioni che avvengano con ritenzione di configurazione, ossia reazioni che non comportano la rottura di nessuno dei legami del centro chirale. Grazie a ciò la disposizione spaziale dei gruppi attorno al centro chirale nel prodotto è la stessa che si ha nel reagente. La convenzione di Fischer-Rosanoff permette quindi di suddividere le molecole chirali, come gli amminoacidi ed i monosaccaridi, in due gruppi, la serie D e la serie L, a seconda che la configurazione attorno al centro chirale sia correlata alla D-gliceraldeide o alla L-gliceraldeide.

Nota: non c’è correlazione tra ritenzione di configurazione e segno del potere rotatorio: il sistema D-L non specifica il segno della rotazione del piano della luce polarizzata provocato dalla molecola chirale, ma semplicemente correla la configurazione della molecola a quella della gliceraldeide.

INDICE

Convenzione di Fischer-Rosanoff e carboidrati

I monosaccaridi possono essere aldosi o chetosi. Gli aldosi, ed i chetosi con più di tre atomi di carbonio hanno almeno un centro chirale, e, per convenzione, apparterranno alla serie D o alla serie L se la configurazione del carbonio chirale più lontano dal carbonio carbonilico, il carbonio più ossidato presente nella molecola, è rispettivamente la stessa della D-gliceraldeide o della L-gliceraldeide.
Nelle proiezioni di Fischer la catena di atomi di carbonio più lunga è orientata verticalmente, e gli atomi di carbonio sono numerati in modo che il carbonio carbonilico abbia il numero più basso possibile, quindi C-1 negli aldosi e C-2 nei chetosi.
Aldosi, chetosi, carbonio carbonilico, centro chirale di riferimento

Nota: in Natura, i carboidrati della serie D sono molto più abbondanti di quelli della serie L.

Se nel nome della molecola deve essere specificato anche il segno della rotazione del piano della luce polarizzata, i prefissi (+) e (-) possono essere utilizzati assieme ai prefissi D ed L. Ad esempio, il fruttosio, che è levorotatorio, verrà indicato come D-(-)-fruttosio, mentre il glucosio, che è destrorotatorio, sarà indicato come D-(+)-glucosio.

Convenzione di Fischer-Rosanoff e α-amminoacidi

Gli amminoacidi, sulla base della posizione del gruppo amminico (–NH2) rispetto a quella del gruppo carbossilico (–COOH) sono classificati come:

  • α-amminoacidi, se il gruppo amminico è legato al carbonio α;
  • β-amminoacidi, se il gruppo amminico è legato al carbonio β;
  • γ-amminoacidi, se il gruppo amminico è legato al carbonio γ;
  • δ-amminoacidi, se il gruppo amminico è legato al carbonio δ.

Considerando gli α-amminoacidi, questi apparterranno rispettivamente alla serie D o alla serie L se la configurazione dei gruppi –NH2, –COOH, ed –R, e dell’atomo di idrogeno legati al carbonio α, il centro chirale, è la stessa di quella dei gruppi idrossile, aldeidico (–CHO), ed idrossimetilico (–CH2OH) e dell’atomo di idrogeno rispettivamente della D-gliceraldeide o della L-gliceraldeide.
Nelle proiezioni di Fischer le molecole sono disposte in modo che il gruppo carbossilico, ossia il carbonio più ossidato, sia in alto, e il gruppo R in basso.
Alfa-Amminoacidi della serie D e della serie L secondo la convenzione di Fischer-RosanoffTra gli α-amminoacidi, gli amminoacidi proteinogenici, con l’eccezione della glicina il cui carbonio α  non è chirale, hanno configurazione L, e si parlerà dunque di L-α-amminoacidi.

Nota: in Natura gli L-α-amminoacidi sono molto più abbondanti rispetto a tutti gli altri tipi di amminoacidi, i quali non partecipano alla sintesi delle proteine.

Configurazioni relative e assolute

Quando Rosanoff assegnò arbitrariamente il prefisso D alla (+)-gliceraldeide ed il prefisso L alla (-)-gliceraldeide, aveva il 50% di probabilità di avere ragione.
Johannes Martin Bijvoet e la configurazione assoluta delle molecole chiraliNei primi anni ’50 del secolo scorso divenne disponibile la tecnologia per stabilire la configurazione assoluta delle molecole chirali, la cristallografia a raggi X, e nel 1951 un chimico olandese, Johannes Martin Bijvoet, stabilì la configurazione assoluta del (+)-tartrato di rubidio e sodio tetraidrato, e, confrontandola con quella della gliceraldeide dimostrò che la supposizione di Rosanoff era corretta. Di conseguenza, le configurazioni dei composti chirali ottenute mettendole in relazione con quelle della gliceraldeide erano configurazioni assolute, ossia le configurazioni relative divennero configurazioni assolute.

Limiti della convenzione di Fischer-Rosanoff

La convenzione di Fischer-Rosanoff da luogo ad incertezze quando si ha a che fare con molecole con più di un centro chirale. Se ad esempio si considera il D-(+)-glucosio, il sistema D-L ci da informazioni circa la configurazione del solo carbonio 2, quando nella molecola sono presenti altri tre centri asimmetrici, i carboni 3, 4 e 5.
Centri asimmetrici del D-(+)-glucosioIn questi casi il sistema RS, sviluppato nel 1956 da Robert Sidney Cahn, Christopher Ingold, e Vladimir Prelog, analizzando ogni singolo centro chirale permette di descrivere senza incertezze la stereochimica della molecola. Nel caso del D-(+)-glucosio si ha la configurazione (2R,3S,4R,5R).
Va anche notato che, utilizzando la convezione di Fischer-Rosanoff, in base al centro chirale scelto come centro di riferimento, una stessa molecola può appartenere sia alla serie D che a quella L.

Bibliografia

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IUPAC. Compendium of Chemical Terminology, 2nd ed. (the “Gold Book”). Compiled by A. D. McNaught and A. Wilkinson. Blackwell Scientific Publications, Oxford (1997). Online version (2019-) created by S. J. Chalk. ISBN 0-9678550-9-8. doi:10.1351/goldbook

Mason S.F. Molecular optical activity and the chiral discriminations. Cambridge University Press, 2009 [Google eBooks]

Moran L.A., Horton H.R., Scrimgeour K.G., Perry M.D. Principles of Biochemistry. 5th Edition. Pearson, 2012

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Proiezioni di Fischer

Hermann Emil FischerNel 1891 il chimico tedesco Hermann Emil Fischer, premio Nobel per la chimica nel 1902, sviluppò un metodo sistematico per la rappresentazione bidimensionale delle molecole chirali, le cosiddette proiezioni di Fischer o formule proiettive di Fischer.
Le proiezioni di Fischer, pur essendo strutture bidimensionali, preservano l’informazione circa la stereochimica della molecola, e, sebbene non siano una rappresentazione di come le molecole potrebbero apparire in soluzione, sono largamente utilizzate dai biochimici per definire la stereochimica degli amminoacidi, dei carboidrati, degli acidi nucleici, dei terpeni, degli steroidi e di molte altre molecole di interesse biologico.

INDICE

Come disegnare le proiezioni di Fischer

Considerando una molecola con un solo centro chirale, supponiamo un atomo di carbonio, per la costruzione della sua proiezione di Fischer la struttura tetraedrica viene ruotata in modo che due legami siano orientati verso il basso mentre gli altri legami siano orientati verso l’alto. Si traccia quindi una croce, al centro della quale si fa cadere il centro chirale, e si dispone la molecola in modo che i gruppi orientati verso il basso, ossia al di sotto del piano del foglio, siano legati alle estremità della linea verticale, mentre i gruppi orientati verso l’alto, dunque al di sopra del piano del foglio, siano legati alle estremità della linea orizzontale.
Come disegnare le proiezione di Fischer di una molecola con un centro chirale
In presenza di più centri chirali si applica lo stesso procedimento ad ognuno di essi.
E’ anche possibile convertire una proiezione di Fischer in una rappresentazione tridimensionale, ad esempio utilizzando i cunei e tratteggi delle formule prospettiche, dove i due legami orizzontali sono rappresentati da cunei solidi, mentre quelli verticali da linee tratteggiate.

Regole per utilizzare le formule proiettive di Fischer

Poiché le proiezioni di Fischer rappresentano in forma bidimensionale strutture tridimensionali, ci sono alcune regole che vanno rispettate per evitare un cambio di configurazione.

  • Le proiezioni non devono essere ribaltate dal piano del foglio ma traslate o girate; con il ribaltamento si ottiene l’altro enantiomero.
  • Se si ruota sul piano la proiezione, per ottenere lo stesso enantiomero dovremo ruotare la figura di 180°, a prescindere dalla direzione di rotazione, in quanto i gruppi verticali devono giacere sotto il piano del foglio mentre quelli orizzontali sopra. Di contro, se le proiezioni sono ruotate di 90° o 270° non verrebbe rispettata la convenzione e un enantiomero è convertito nell’altro.
    Regole per utilizzare le proiezione di Fischer
  • Un numero di dispari di scambi di due gruppi porta all’altro enantiomero.

Bibliografia

Garrett R.H., Grisham C.M. Biochemistry. 4th Edition. Brooks/Cole, Cengage Learning, 2010

IUPAC. Compendium of Chemical Terminology, 2nd ed. (the “Gold Book”). Compiled by A. D. McNaught and A. Wilkinson. Blackwell Scientific Publications, Oxford (1997). Online version (2019-) created by S. J. Chalk. ISBN 0-9678550-9-8. doi:10.1351/goldbook

Moran L.A., Horton H.R., Scrimgeour K.G., Perry M.D. Principles of Biochemistry. 5th Edition. Pearson, 2012

Voet D. and Voet J.D. Biochemistry. 4th Edition. John Wiley J. & Sons, Inc. 2011

Resa energetica del glicogeno in condizioni anaerobiche ed aerobiche

Il glicogeno è, con lipidi, un riserva di energia cui l’organismo può attingere nel momento del bisogno. Sebbene quantitativamente inferiore rispetto ai lipidi, il glicogeno ha alcuni vantaggi metabolici.

  • E’ mobilizzato più velocemente rispetto ai lipidi.
  • E’ una riserva di glucosio cui attingere per mantenere entro l’intervallo di normalità la glicemia nel digiuno, durante l’attività fisica e tra i pasti.
  • Può essere utilizzato come fonte di energia sia in condizioni aerobiche che in condizioni anaerobiche.

Considerando l’ultimo punto, la resa energetica del glucosio rilasciato dal glicogeno è differente in condizioni anerobiche ed aerobiche. Di seguito si analizzeranno le basi metaboliche di queste differenze.

INDICE

Resa energetica del glicogeno in condizioni anaerobiche

In condizioni anaerobiche, l’ossidazione di una molecola di glucosio a lattato attraverso la glicolisi anaerobica porta alla produzione di due molecole di ATP.
Di seguito viene analizzata la resa in ATP dall’ossidazione anaerobica del glucosio rilasciato dal glicogeno nel corso della glicogenolisi per azione della glicogeno fosforilasi (EC 2.4.1.1), che porta alla liberazione di circa il 90% del glucosio immagazzinato in forma di glucosio-1-fosfato, abbreviato G-1-P, e dell’enzima deramificante (EC 3.2.1.33), responsabile del rilascio del restante 10% delle unità monosaccaridiche in forma non fosforilata, quindi come glucosio.

Glicogeno fosforilasi e ossidazione del G-1-P in condizioni anaerobiche

La sintesi del glicogeno dal glucosio comporta il consumo di due molecole di ATP per ogni molecola immagazzinata.
Il rilascio di una molecola di glucosio-1-fosfato per azione della glicogeno fosforilasi permette il risparmio di una delle due molecole di ATP utilizzate nella fase preparatoria della glicolisi. L’ossidazione anaerobica del glucosio-6-fosfato, prodotto dal glucosio-1-fosfato nella reazione catalizzata dalla fosfoglucomutasi (EC 5.4.2.2), porta alla produzione di tre molecole di ATP e non due, in quanto:

  • nella fase preparatoria della glicolisi è consumata una molecola di ATP e non due, essendo bypassata la reazione catalizzata dalla esochinasi (EC 2.7.1.1);
  • quattro molecole di ATP sono prodotte nella fase di recupero energetico della glicolisi.

Il rapporto spesa-guadagno è 1/3, quindi si ha una resa energetica di circa il 66,7%.
La reazione complessiva è:

Glicogeno(n residui di glucosio) + 3 ADP + 3 Pi → Glicogeno(n-1 residui di glucosio) + 2 Lattato + 3 ATP

Considerando le due molecole di ATP spese nel corso della sintesi del glicogeno e l’ossidazione anaerobica del glucosio-1-fosfato a lattato, si ha una resa pari ad una molecola di ATP per molecola di glucosio immagazzinata.
La reazione complessiva è:

Glucosio + ADP + Pi → 2 Lattato + ATP

Enzima deramificante e ossidazione del glucosio in condizioni anaerobiche

Considerando il glucosio liberato per azione dell’enzima deramificante, la resa in ATP è pari a zero in quanto:

  • la sintesi del glicogeno dal glucosio comporta la spesa di due molecole di ATP;
  • l’enzima deramificante libera glucosio, dunque nella fase preparatoria della glicolisi saranno spese due molecole di ATP;
  • quattro molecole di ATP sono prodotte nella fase di recupero energetico della glicolisi.

Se ora si considera l’ossidazione sino a lattato di tutto il glucosio provenienti dal glicogeno si ha una resa energetica pari a:

1-{[(1/3)*0,9]+[(2/2)*0,1]}=0,60

Ne consegue che in condizioni anaerobiche, si ha una resa energetica pari al 60%, e quindi il glicogeno rappresenta una buona forma di riserva di energia.

Resa energetica del glicogeno in condizioni aerobiche

In condizioni aerobiche, l’ossidazione di una molecola di glucosio a CO2 e H2O attraverso glicolisi, complesso della piruvato deidrogenasi, ciclo di Krebs, catena di trasporto degli elettroni mitocondriale e fosforilazione ossidativa porta alla produzione di circa 30 molecole di ATP.
Di seguito viene analizzata la resa in ATP dall’ossidazione aerobica del glucosio rilasciato dal glicogeno per azione della glicogeno fosforilasi e dell’enzima deramificante.

Glicogeno fosforilasi e ossidazione del G-1-P in condizioni aerobiche

Dall’ossidazione del glucosio-6-fosfato, prodotto dal glucosio-1-fosfato per azione della fosfoglucomutasi, a CO2 e H2O si ottengono 31 molecole di ATP e non 30, grazie all’ATP risparmiato nella fase preparatoria della glicolisi. Dunque, il rapporto spesa-guadagno è di 1/31, con una resa energetica di circa il 97%.
La reazione complessiva è:

Glicogeno(n residui di glucosio) + 31 ADP + 31 Pi → Glicogeno(n-1 residui di glucosio) + 31 ATP + 6 CO2 + 6 H2O

Considerando le due molecole di ATP spese per molecola di glucosio immagazzinata nel glicogeno e l’ossidazione aerobica del glucosio-1-fosfato a CO2 e H2O, si ha una resa pari a 29 molecole di ATP per unità di glucosio immagazzinata.
La reazione complessiva è:

Glucosio + 29 ADP + 29 Pi → 29 ATP + 6 CO2 + 6 H2O

Enzima deramificante e ossidazione del glucosio in condizioni aerobiche

Considerando le unità di glucosio liberate dall’enzima deramificante, la resa in ATP è pari a 30 molecole in quanto la fase preparatoria della glicolisi comporta la spesa di due molecole di ATP. Quindi, il rapporto spesa-guadagno è 2/30, con una resa energetica di circa il 93,3%.
Se ora si considera l’ossidazione a CO2 e H2O di tutte le unità di glucosio provenienti dal glicogeno, si ha una resa energetica pari a:

1-{[(1/31)*0,9]+[(2/30)*0,1]}=0,96

Resa energetica glicogeno condizioni anaerobiche aerobiche
Ne consegue che, in condizioni aerobiche, si ha una resa energetica pari al 96%, e quindi il glicogeno rappresenta una forma di riserva di energia estremamente efficiente, con un guadagno del 36% rispetto alle condizioni anaerobiche.

Bibliografia

Nelson D.L., Cox M.M. Lehninger. Principles of biochemistry. 6th Edition. W.H. Freeman and Company, 2012

Stipanuk M.H., Caudill M.A. Biochemical, physiological, and molecular aspects of human nutrition. 3rd Edition. Elsevier health sciences, 2013 [Google eBooks]

Voet D. and Voet J.D. Biochemistry. 4th Edition. John Wiley J. & Sons, Inc. 2011

Sistema RS: le regole di priorità

Nel 1956, Robert Sidney Cahn, Christopher Ingold, e Vladimir Prelog misero a punto un sistema di nomenclatura che, basandosi su poche e semplici regole, permette di assegnare la configurazione assoluta ad ogni centro di chiralità presente in una molecola.
Questo sistema di nomenclatura, chiamato sistema RS o convenzione di Cahn-Ingold-Prelog, quando accoppiato con il sistema di nomenclatura IUPAC, permette di assegnare in maniera accurata e priva di ambiguità il nome alle molecole chirali, anche quando è presente più di un centro asimmetrico.
Le molecole chirali sono, nella maggior parte dei casi, in grado di far ruotare il piano della luce polarizzata quando questa attraversa una soluzione che le contenga. A questo riguardo va sottolineato che il segno del potere rotatorio non da alcuna informazione circa la configurazione RS dei centri chirali della molecola.
La convenzione di Fischer-Rosanoff è un altro sistema di nomenclatura per le molecole chirali. Tuttavia, rispetto al sistema RS, non analizza ogni singolo centro chirale ma assegna un nome all’intera molecola, e spesso presenta ambiguità con molecole con più centri chirali.

INDICE

Le regole di priorità del sistema RS

Il sistema RS assegna un ordine di priorità ai gruppi legati ad un centro chirale e, tracciando una circonferenza dal gruppo a priorità maggiore verso quello a priorità minore, assegna la configurazione R o S al centro chirale.

Prima regola

Si assegna un ordine di priorità ai gruppi, sulla base del numero atomico dell’atomo direttamente legato al centro chirale.

  • L’atomo con il numero atomico più alto ha la priorità più alta.
  • L’atomo con il numero atomico più basso ha la priorità più bassa.

Ad esempio, se un atomo di ossigeno, O, numero atomico 8, di carbonio, C, numero atomico 6, di cloro, Cl, numero atomico 17, e di bromo, Br, numero atomico 35, sono legati ad un centro chirale, l’ordine di priorità sarà: Br > Cl> O > C.
Considerando gli isotopi, l’atomo con la massa atomica più alta ha la priorità più alta.

Seconda regola

Quando gruppi differenti sono legati al centro di chiralità attraverso identici atomi, l’ordine di priorità è assegnato in base al numero atomico dell’atomo successivo a quello legato al centro, allontanandoci dal centro chirale finché non si raggiunge il primo punto di differenza.
Se, per esempio, i gruppi –CH3, –CH2CH3 e –CH2OH sono legati al centro di chiralità, ci sono tre atomi identici attaccati direttamente ad esso. Analizzando gli atomi successivi, si ha:

  • per il gruppo metilico –CH3
H, H, H
  • per il gruppo etilico –CH2CH3
H, H, C
  • per il gruppo idrossimetilico –CH2OH
H, H, O

Sistema RS assegnazione ordine di priorità: prima regolaPoiché il numero atomico dell’atomo di ossigeno è maggiore di quello dell’atomo di carbonio, che a sua volta è maggiore di quello dell’atomo di idrogeno, l’ordine di priorità sarà –CH2OH > –CH2CH3 > –CH3.
Per alcuni gruppi l’ordine di priorità è il seguente:

–I > –Br > –Cl > –SH > –OR > –OH > –NHR > –NH2 > –COOR > –COOH > –CHO > –CH2OH > –C6H5 > –CH3 > –2H > –1H

Si noti che i gruppi legati ad un centro chirale devono avere un differente grado priorità altrimenti il centro non può essere chirale.

Stabilito l’ordine di priorità, si orienta la molecola nello spazio in modo che il gruppo a priorità più bassa sia diretto in direzione opposta a quella dell’osservatore, quindi dietro il centro chirale. A questo punto si congiungono i gruppi rimasti con una circonferenza, in modo che la successione sia secondo priorità decrescente: dal gruppo a priorità più alta verso quello a priorità più bassa.

  • Se tracciando questa circonferenza si segue una direzione oraria, la configurazione del centro chirale è R, dal latino rectus che significa “destra”.
  • Se tracciando la circonferenza si segue una direzione antioraria, la configurazione del centro chirale è S, dal latino sinister che significa “sinistra”.

Centro chirale configurazione R

Terza regola

Questa può essere considerata come la terza regola del sistema RS, grazie alla quale è possibile assegnare la configurazione ad un centro chirale anche quando sono presenti di doppi o tripli legami nei gruppi legati al centro stesso.
Ai fini dell’attribuzione delle priorità, gli atomi impegnati nei legami multipli sono considerati duplicati, nel caso di un doppio legame, e triplicati, nel caso di un triplo legame.
Sistema RS assegnazione ordine di priorità: terza regola
Nel caso di doppio legame C=Y, un atomo Y sarà da legare sull’atomo di carbonio, e un atomo di carbonio sull’atomo Y.
Nel caso di un triplo legame C≡Y, due atomi Y verranno legati sull’atomo di carbonio, e due atomi di carbonio sull’atomo Y.

Sistema RS in presenza di più centri chirali

Quando in una molecola sono presenti due o più centri chirali, si procede analizzando in modo indipendente ciascun centro, utilizzando le regole viste in precedenza.
Consideriamo il 2,3-butandiolo. La molecola ha due centri chirali, il carbonio 2 ed il carbonio 3, e tre stereoisomeri: due enantiomeri ed un composto meso. Qual è la configurazione RS dei centri chirali dell’enantiomero in figura?

Configurazione RS centri chirali (2R,3R)-2,3-butandioloSi consideri il carbonio 2. L’ordine di priorità dei gruppi legati è: –OH > –CH2OHCH3 > –CH3 > –H. Si ruoti la molecola in modo che l’idrogeno, il gruppo con la priorità più bassa, sia diretto in direzione opposta all’osservatore. Disegnando una circonferenza partendo dal gruppo –OH, il gruppo con la priorità più alta, verso il gruppo –CH3, il gruppo a priorità più bassa, ci si muove in senso antiorario, per cui la configurazione del carbonio 2 è R. Applicando la stessa procedura al carbonio 3, si scopre che la sua configurazione è R. Quindi l’enantiomero in figura è il (2R,3R)-2,3-butandiolo.

Aminoacidi e gliceraldeide

Nella convenzione di Fischer-Rosanoff tutti gli aminoacidi proteinogenici sono L-aminoacidi. Nel sistema RS, con l’eccezione della glicina che è achirale, e della cisteina che, per la presenza del gruppo tiolico è la (R)-cisteina, tutti gli altri aminoacidi proteinogenici hanno configurazione S.
La treonina e l’isoleucina posseggono due centri chirali, il carbonio alfa ed un atomo di carbonio sulla catena laterale, e tre stereoisomeri: due enantiomeri ed un composto meso. Le forme dei due amminoacidi isolate dalle proteine sono la (2S,3R)-treonina e la (2S,3S)-isoleucina, secondo la convenzione di Fischer-Rosanoff la L-treonina e la L-isoleucina.
Nel sistema RS, la L-gliceraldeide ha il centro chirale con configurazione S, per cui è indicata come (S)-gliceraldeide; ovviamente la D-gliceraldeide sarà la (R)-gliceraldeide.

Bibliografia

Cahn R.S., Ingold C., Prelog V. Specification of molecular chirality. Angew Chem 1966:5(4); 385-415. doi:10.1002/anie.196603851

Garrett R.H., Grisham C.M. Biochemistry. 4th Edition. Brooks/Cole, Cengage Learning, 2010

IUPAC. Compendium of Chemical Terminology, 2nd ed. (the “Gold Book”). Compiled by A. D. McNaught and A. Wilkinson. Blackwell Scientific Publications, Oxford (1997). Online version (2019-) created by S. J. Chalk. ISBN 0-9678550-9-8. doi:10.1351/goldbook

Moran L.A., Horton H.R., Scrimgeour K.G., Perry M.D. Principles of Biochemistry. 5th Edition. Pearson, 2012

Prelog V. and Helmchen G. Basic principles of the CIP‐system and proposals for a revision. Angew Chem 1982:21(8);567-83. doi:10.1002/anie.198205671

Rosanoff M.A. On Fischer’s classification of stereo-isomers. J Am Chem Soc 1906:28(1);114-121. doi:10.1021/ja01967a014

Voet D. and Voet J.D. Biochemistry. 4th Edition. John Wiley J. & Sons, Inc. 2011

Chiralità

La definizione di chiralità, dal greco cheir che significa “mano”, si deve a Lord Kelvin che la enunciò nel corso delle “Baltimore Lectures”, una serie di lezioni tenute alla Johns Hopkins University di Baltimora a partire dal primo ottobre del 1884, e pubblicate venti anno dopo, nel 1904, in cui lo scienziato inglese, tra le altre cose, affermava: “I call any geometrical figure, or groups of points, chiral, and say it has chirality, if its image in a plane mirror, ideally realized, cannot be brought to coincide with itself”.
Lord Kelvin e la Definizione di ChiralitàDunque, la chiralità è la proprietà geometrica di un insieme di punti o atomi nello spazio, o di oggetti solidi, di non essere sovrapponibili alla loro immagine speculare. Questi strutture, definite chirali, hanno la caratteristica peculiare di essere prive di elementi di simmetria del secondo ordine, ossia un piano di simmetria, un centro di inversione, o un asse di roto-riflessione.
L’ambiente che ci circonda è ricco di oggetti chirali: le nostre mani ne sono l’esempio per eccellenza, ma ce ne sono moltissimi altri, dal guscio di una chiocciola sino ad una galassia a spirale. In chimica, e in special modo in chimica organica, la chiralità è una proprietà di importanza primaria, in quanto molecole come i carboidrati, molti amminoacidi, nonchè moltissimi farmaci, sono chirali.
Le molecole chirali possono esistere in due forme, l’una immagine speculare dell’altra e non sovrapponibili, ossia, non esiste una combinazione di rotazioni o traslazioni sul piano del foglio che consenta la loro sovrapposizione. Queste molecole sono dette enantiomeri, dal greco enántios che significa “contrario” e meros che significa “parte”.
La causa più comune di chiralità in una molecola è la presenza di un centro di chiralità o centro chirale, anche detto centro asimmetrico, cioè un atomo che leghi un insieme di ligandi disposti nello spazio in modo che la molecola risultante possa esistere come due enantiomeri.
Gli enantiomeri a loro volta sono un tipo di stereoisomeri, i quali possono essere definiti come isomeri che hanno lo stesso numero e tipo di atomi e legami, ma che differiscono nell’orientamento spaziale degli atomi.

INDICE

Gli enantiomeri

Due enantiomeri di una molecola chirale, non essendo sovrapponibili, sono composti differenti. In che cosa differiscono?
Ciascuna coppia di enantiomeri possiede identiche proprietà fisiche e chimiche verso tutto ciò che non è chirale come il punto di fusione, il punto di ebollizione, l’indice di rifrazione, lo spettro infrarosso, la solubilità in uno stesso solvente, o la velocità di reazione con i reagenti achirali.
Le differenze emergono quando la coppia enantiomerica viene fatta interagire con fenomeni chimici e fisici che abbiano natura chirale.

  • Dal punto di vista chimico, due enantiomeri possono essere distinti quando si trovano ad interagire con strutture chirali, come il sito di legame di un recettore chirale o il sito attivo di un enzima chirale.
  • Dal punto di vista fisico due enantiomeri differiscono nelle interazioni con la luce polarizzata, che ha proprietà chirali, sono cioè dotati di attività ottica.

Chiralità ed attività ottica

L’attività ottica di materiali come il quarzo e, più importante, di composti organici come zuccheri o l’acido tartarico, fu scoperta nel 1815 dallo scienziato francese Jean-Baptiste Biot.
Le molecole chirali possono essere classificate sulla base della direzione in cui viene ruotato il piano della luce polarizzata quando attraversa una soluzione che le contenga.

  • Se una soluzione di un enantiomero ruota il piano della luce polarizzata in senso orario dal punto di vista dell’osservatore, la molecola viene definita destrogira o destrorotatoria, dal latino dexter che significa “destro”, ed suo nome è preceduto dai prefissi (+), o d, da dextro-.
  • Se una soluzione di un enantiomero ruota il piano della luce polarizzata in senso antiorario dal punto di vista dell’osservatore, la molecola è definita levogira o levorotatoria, dal latino laevus che significa “sinistro”, ed il suo nome è preceduto dai prefissi (-), o l, da laevo-.

Ovviamente, considerando una coppia di enantiomeri, uno sarà destrogiro e l’altro non potrà che essere levogiro.
Al momento non è ancora possibile predire in modo affidabile ne la grandezza, la direzione, o il segno della rotazione del piano della luce polarizzata indotta da un enantiomero. D’altro canto, neppure l’attività ottica di una molecola da alcun tipo di informazione riguardo alla disposizione spaziale dei gruppi chimici legati al centro di chiralità.
Nota: un sistema contenente molecole che abbiamo lo stesso senso di chiralità è chiamato enantiomericamente puro o enantiopuro.

Pasteur e la scoperta degli enantiomeri

Louis Pasteur e la scoperta degli enantiomeriNel 1848, trentatre anni dopo il lavoro di Biot, studi sull’attività ottica delle molecole portarono Louis Pasteur, che di Biot era stato studente, a notare che, a seguito della ricristallizzazione di una soluzione acquosa concentrata di sodio ammonio tartrato, di per se otticamente inattiva, precipitavano due tipi di cristalli che erano l’uno l’immagine speculare dell’altro e non sovrapponibili. Dopo averli separati con delle pinzette, Pasteur si accorse che le soluzioni ottenute sciogliendo quantità equimolari dei due cristalli erano otticamente attive e, cosa forse più interessante, l’angolo di rotazione del piano della luce polarizzata era lo stesso ma di segno opposto. Poiché queste differenze nell’attività ottica erano dovute alle molecole di sodio ammonio tartrato disciolte, Pasteur ipotizzò che le molecole stesse dovessero essere l’una l’immagine speculare dell’altra e non sovrapponibili, al pari dei loro cristalli, quelli che oggi chiamiamo enantiomeri. E fu Pasteur che per primo coniò il termine asimmetria per descrivere questa proprietà, definita in seguito chiralità da Lord Kelvin.

Miscele racemiche

Una soluzione che contenga quantità equimolari di ciascun membro di una coppia di enantiomeri è detta miscela racemica o racemo. Queste soluzioni sono otticamente inattive in quanto l’effetto rotatorio di un enantiomero è esattamente compensato da quello dell’altro enantiomero.
A differenza di quanto accade nei processi biochimici, la sintesi chimica di molecole chirali che non preveda il ricorso a reagenti chirali, o che non sia seguita da metodiche di separazione degli enantiomeri, porta inevitabilmente alla produzione di una miscela racemica.
Il settore che più a risentito di questo fenomeno è quello della chimica farmaceutica. Come detto in precedenza, due enantiomeri sono molecole differenti. Molti farmaci chirali sono sintetizzati come miscele racemiche, ma molto spesso l’attività farmacologica desiderata è presente solamente in uno dei due enantiomeri, detto eutomero. L’altro enantiomero, detto distomero, è inattivo o meno attivo. Un esempio è il farmaco antiinfiammatorio ibuprofene, un derivato arilpropionico: solamente l’enantiomero S è dotato di attività farmacologica.

Enantiomeri dell'IbuprofeneI derivati arilpropionici vengono venduti come miscele racemiche perché a livello epatico una racemasi converte il distomero in eutomero.
Tuttavia è anche possibile che il distomero produca effetti dannosi e debba essere eliminato dalla miscela racemica. Un tragico esempio è la talidomide, un sedativo ed anti-nausea commercializzato come miscela racemica dagli anni ‘50 fino al 1961, ed utilizzato anche in gravidanza.

Enantiomeri della TalidomideIl distomero, l’enantiomero S, poteva causare gravi difetti alla nascita, in particolare la focomelia. Questo è forse l’esempio più eclatante dell’importanza delle proprietà chirali delle molecole, che ha poi spinto gli organismi di salute pubblica a promuovere, da parte dell’industria farmaceutica , la sintesi di farmaci, talidomide compresa, contenenti un singolo enantiomero.

Centri di chiralità

Un qualsiasi atomo tetraedrico che leghi quattro ligandi differenti può essere un centro chirale.
L’esempio classico è l’atomo di carbonio, ma anche altri atomi appartenenti al gruppo IVA della tavola periodica, come i semimetalli silicio (Si) ed il germanio (Ge), formano composti a struttura tetraedrica e possono essere centri di chiralità. Anche l’atomo di fosforo negli organofosfati ha una geometria tetraedrica, quindi, quando lega quattro diversi sostituenti, è un centro chirale.
L’atomo di azoto di un’ammina terziaria, un’ammina dove tre gruppi organici differenti sono legati all’azoto, è un centro chirale. In questi composti l’atomo di azoto è disposto al centro di un tetraedro ed i suoi quattro orbitali ibridi sp3 sono diretti verso i vertici, tre dei quali sono occupati dai tre sostituenti, mentre verso il quarto è diretta la coppia di elettroni solitaria.
Inversione dell'azoto e chiralitàA temperatura ambiente, l’azoto inverte rapidamente la sua configurazione. Il fenomeno è noto come inversione dell’azoto, ossia, una rapida oscillazione dell’atomo e dei suoi ligandi, nel corso della quale l’azoto passa attraverso uno stato di transizione planare in cui ha ibridazione sp2. Come conseguenza, se l’atomo di azoto è il solo centro chirale della molecola, non c’è attività ottica in quanto si viene a formare una miscela racemica. L’inversione di configurazione viene evitata solamente in alcuni casi in cui l’azoto fa parte di una struttura ciclica che la impedisce. Dunque, la presenza di un centro chirale può non essere sufficiente per permettere la separazione dei rispettivi enantiomeri.

Nota: nel 1874, Jacobus Henricus van ‘t Hoff e Joseph Achille Le Bel basandosi anche sui risultati ottenuti da Pasteur, per primi ipotizzarono la “teoria dell’atomo di carbonio tetraedrico”. Per questo lavoro van ’t Hoff ricevette il primo premio Nobel per la chimica nel 1901.

Molecole chirali senza centri chirali

La chiralità può essere presente anche in assenza di un centro chirale, ed essere conseguenza della mancanza di libera rotazione attorno ad un legame doppio o singolo, come nel caso dei:

  • derivati allenici, composti organici che presentano due doppi legami cumulati, cioè due doppi legami localizzati sullo stesso atomo di carbonio;
  • derivati bifenilici.

Chiralità conseguente alla presenza di un asse chiraleIn questo caso la chiralità è conseguente alla presenza di un asse chirale.

Composti meso

I composti meso o forme meso sono stereoisomeri che possiedono due o più centri chirali ma sono sovrapponibili alla loro immagine speculare, dunque sono achirali, e come tali otticamente inattivi. Inoltre posseggono un piano di simmetria interno che taglia la molecola in due metà, ognuna immagine speculare dell’altra. I composti meso possono quindi essere classificati come diastereoisomeri, ossia stereoisomeri diversi dagli enantiomeri.
Per una molecola con n centri di chiralità il numero massimo di possibili stereoisomeri è 2n.
Si consideri il 2,3-butandiolo. La molecola presenta due centri di chiralità, i carboni 2 e 3, quindi si potrebbero avere 22 = 4 stereoisomeri, le cui strutture sono riportate in figura, secondo le proiezioni di Fischer, ed indicate come A, B, C, D.
Stereoisomeri, centri di chiralità e mesocompostiLe strutture A e B sono l’una l’immagine speculare dell’altra e non sono sovrapponibili, dunque sono una coppia di enantiomeri.
Le strutture C e D sono l’una l’immagine speculare dell’altra, ma sono sovrapponibili. Se infatti si ruota la struttura C o D di 180°, le due strutture si possono sovrapporre. Quindi non sono enantiomeri: sono la stessa molecola scritta con orientamento differente. Inoltre hanno un piano di simmetria interno che le suddivide in due metà, l’una immagine speculare dell’altra. Dunque, la struttura C (o D) è un composto meso perché ha centri chiarali, è sovrapponibile alla sua immagine speculare e presenta un piano di simmetria interno che divide la molecola in due metà speculari.

Bibliografia

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Isomeria di struttura e stereoisomeria: definizione, tipi, ed esempi

Il fenomeno per cui due o più composti chimici differenti presentano la stessa formula molecolare è chiamato isomeria, dal greco isos che significa uguale e meros che significa parte, concetto e termine introdotti dallo scienziato svedese Jacob Berzelius nel 1830.
L’isomeria è conseguenza del fatto che gli atomi presenti in una stessa formula molecolare possono unirsi in diversi modi a dare composti, detti isomeri, che posseggono proprietà fisiche e chimiche differenti.
L’isomeria può essere di due tipi: isomeria di struttura e stereoisomeria, a loro volta suddividibili in ulteriori sottotipi.

Schema delle Diverse Tipologie di Isomeria

INDICE

Isomeria di struttura

Nella isomeria di struttura, anche detta strutturale o di costituzione, gli isomeri differiscono tra di loro in quanto gli atomi costituenti sono legati con in modi e sequenze differenti.
Esistono diversi sottotipi di isomeria di struttura: l’isomeria di posizione, di gruppo funzionale e di catena.

Isomeri di posizione

Nella isomeria di posizione o posizionale gli isomeri hanno gli stessi gruppi funzionali ma disposti in posizioni diverse sulla stessa catena carboniosa.
Un esempio è il composto di formula molecolare C6H4Br2, di cui esistono tre isomeri: l’1,2-dibromobenzene, l’1,3-dibromobenzene e l’1,4-dibromobenzene. I tre isomeri differiscono per la posizione degli atomi di bromo sulla struttura ciclica.

Isomeria Posizionale

Un altro esempio è il composto di formula molecolare C3H8O, di cui esistono due isomeri: 1-propanolo o alcol n-propilico, ed il 2-propanolo o alcol isopropilico. Questi isomeri differiscono per la posizione del gruppo ossidrilico lungo la catena carboniosa.

Isomeri di Posizione

Isomeri di gruppo funzionale

Nella isomeria di gruppo funzionale, anche detta isomeria funzionale, gli atomi sono organizzati in modo da dare luogo alla formazione di gruppi funzionali diversi.
Un esempio è il composto di formula molecolare C2H6O, di cui esistono due isomeri: il dimetiletere o etere dimetilico e l’etanolo o etil alcool, che presentano gruppi funzionali diversi, un gruppo etere, –O–, ed un gruppo ossidrilico, –OH.

Isomeria di Gruppo Funzionale

Isomeri di catena

Nella isomeria di catena gli isomeri differiscono nella disposizione delle catene carboniose, che possono essere ramificate o lineari.
Un esempio è il composto di formula molecolare C5H12, di cui esistono tre isomeri: l’n-pentano, il 2-metilbutano o isopentano ed il 2,2-dimetilpropano o neopentano.

Isomeri di Catena

Stereoisomeria

Nella stereoisomeria gli isomeri hanno lo stesso numero e tipo di atomi e legami ma differiscono nella orientazione degli atomi nello spazio. Questi isomeri sono detti stereoisomeri, dal greco stereos che significa “solido”.
La stereoisomeria può essere di due tipi: isomeria conformazionale ed isomeria configurazionale. Quest’ultima è suddividibile in due ulteriori sottotipi, l’isomeria ottica e l’isomeria geometrica.

Isomeria conformazionale

Nella isomeria conformazionale gli stereoisomeri possono essere interconvertiti tra a seguito di rotazioni attorno ad uno o più legami singoli, i legami σ. Queste rotazioni producono disposizioni differenti degli atomi nello spazio che non sono sovrapponibili. Inoltre, il numero delle possibili conformazioni che una molecola può assumere è in teoria infinito, variando dalla struttura a più bassa energia, la più stabile, a quella a più alta energia, la meno stabile. Ciascun isomero è definito conformero.
Se ad esempio si considera l’etano, di formula molecolare C2H4, guardando la molecola da una estremità lungo la direzione del legame carbonio-carbonio, gli atomi di idrogeno di un gruppo metilico possono trovarsi rispetto agli atomi di idrogeno dell’altro gruppo metilico in una delle seguenti conformazioni.

  • In conformazione eclissata, nella quale gli atomi di idrogeno di un gruppo metilico sono nascosti da quelli dell’altro gruppo metilico, quindi l’angolo tra i legami carbonio-idrogeno tra i carboni anteriori e posteriori, detto angolo diedro, può essere 0, 120, 240 o 360 gradi. Questa è la conformazione a più alta energia, dunque la meno stabile.
  • In conformazione sfalsata, nella quale gli atomi di idrogeno di un gruppo metilico sono completamente sfalsati rispetto a quelli dell’altro gruppo metilico, quindi l’angolo diedro può essere 60, 180 o 300 gradi. Questa è la conformazione a più bassa energia, quindi la più stabile.
  • In conformazioni sgembe, che corrispondono ad una qualsiasi delle conformazioni intermedie tra le due precedenti.

Conformeri dell'Etano: Proiezioni di Newman
La maggiore o minore stabilità dei conformeri dipende dal grado di sovrapposizione delle coppie di elettroni dei legami carbonio-idrogeno dei due gruppi metilici:

  • nella conformazione sfalsata la distanza è la massima possibile;
  • nella conformazione eclissata le coppie elettroniche sono alla distanza minima possibile.

La barriera di energia potenziale tra le due conformazioni opposte è piccola, circa 2,8 kcal/mole (11,7 kJ/mole). A temperatura ambiente l’energia cinetica posseduta dalle molecole è di 15-20 kcal/mole (62,7-83,6 kJ/mole), più che sufficiente a permettere la libera rotazione attorno al legame carbonio-carbonio. Di conseguenza non è possibile isolare i singoli conformeri dell’etano.
Nota: considerando il doppio legame carbonio-carbonio, la barriera di energia potenziale che si oppone alla libera rotazione attorno al doppio legame è di circa 63 kcal/mole (264 kJ/mole), e corrisponde all’energia necessaria per rompere il legame π (Vedi isomeria geometrica). Questa quantità di energia è circa tre volte l’energia cinetica posseduta dalle molecole a temperatura ambiente, alla quale quindi la libera rotazione è impedita. Solamente a temperature superiori ai 300° le molecole acquistano un’energia termica sufficiente a rompere il legame π, permettendo così la libera rotazione intorno al legame σ rimanente, e quindi l’interconversione tra gli isomeri cis e trans.

Isomeria configurazionale

Nella isomeria configurazionale l’interconversione tra gli isomeri non avviene a seguito di rotazioni attorno a legami singoli ma comporta la rottura di legami e la formazione di nuovi legami, quindi a temperatura ambiente non avviene spontaneamente.
Esistono due sottotipi di isomeria configurazionale: l’isomeria ottica e l’isomeria geometrica.

Isomeri ottici

L’isomeria ottica è caratteristica delle molecole che hanno uno o più centri di chiralità o centri chirali, ossia un atomo tetraedrico che leghi quattro ligandi differenti. Il centro chirale può essere un atomo di carbonio, fosforo, zolfo o azoto.

Centro Chirale o di Chiralità
Nota: la parola chiralità deriva dal greco cheiros che significa “mano”.
Gli isomeri ottici mancano di un centro di simmetria o di un piano di simmetria, sono immagini speculari gli uni degli altri, e non sono sovrapponibili. Questi stereoisomeri sono detti enantiomeri, dal greco enántios che significa “contrario”.
A differenza degli altri isomeri, due enantiomeri hanno identiche proprietà fisiche e chimiche con due sole eccezioni.

  • La direzione di rotazione del piano della luce polarizzata, da cui il nome di isomeria ottica.
    Se una soluzione di un enantiomero ruota il piano della luce polarizzata in senso orario, l’enantiomero viene indicato con il simbolo (+). Di contro, una soluzione dell’altro enantiomero ruota il piano della luce polarizzata in senso antiorario dello stesso angolo, e l’enantiomero è indicato con il simbolo (-).
  • Sebbene spesso indistinguibili dalla maggior parte delle tecniche, due enantiomeri possono essere distinti in un ambiente chirale, come il sito attivo di enzimi chirali.

Si noti che per una molecola con n centri chirali esiste un numero massimo di stereoisomeri pari a 2n.


Isomeri geometrici

L’isomeria geometrica, anche detta isomeria cis-trans, è caratteristica delle molecole dove non è possibile la libera rotazione tra due atomi per la presenza di strutture rigide come:

  • i composti con doppi legami carbonio-carbonio, carbonio-azoto o azoto-azoto, dove la rigidità è dovuta al doppio legame;
  • i composti ciclici, dove la rigidità è dovuta alla presenza dell’anello.

Un esempio di isomeria geometrica dovuta ad un doppio legame carbonio-carbonio si ha con lo stilbene, composto di formula molecolare C14H12, di cui esistono due isomeri. In uno, definito isomero cis, i gruppi uguali sono dalla stessa parte rispetto al piano individuato dal doppio legame, mentre nell’altro, detto isomero trans, i gruppi uguali sono da parti opposte.

Isomeria GeometricaNota: i termini trans e cis derivano dal latino trans che significa “al di la”, e cis che significa “di qua”.
Tra i composti ciclici, l’isomeria cis-trans non complicata dalla presenza di centri chirali si osserva nei sistemi con numero pari di atomi di carbonio e sostituiti in posizioni opposte, ossia para-sostituiti. Un esempio è l’1,4-dimetilcicloesano, un cicloalcano, idrocarburi ciclici di formula generale CnH2n,, di cui esistono due stereoisomeri, il cis-1,4-dimetilcicloesano ed il trans-1,4-dimetilcicloesano.

Isomeri cis-trans

Questo tipo di stereoisomeria non può esistere nel caso in cui uno dei due atomi non liberi di ruotare leghi due gruppi identici. Perché? Per passare dallo stereoisomero cis a quello trans è necessario scambiare tra di loro i due gruppi legati ad uno dei due atomi impegnati nel doppio legame. Se i due gruppi sono uguali lo scambio porta alla formazione della stessa molecola.
Nota: gli isomeri geometrici sono un caso particolare di diastereomeri o diastereoisomeri, che, a loro volta, sono stereoisomeri che non sono l’uno l’immagine speculare dell’altro. Gli altri diastereomeri sono i composti meso e gli isomeri ottici non enantiomerici.


Bibliografia

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Pressione osmotica

In una soluzione, le molecole di solvente tendono a spostarsi dalla regione dove la loro concentrazione è maggiore verso quella a concentrazione minore. Se si considerano due soluzioni separate da una membrana semipermeabile, ossia una membrana che consenta il passaggio solo a certi ioni o molecole, in questo caso le molecole di solvente, si verrà a creare attraverso la membrana un flusso netto di molecole di solvente dalla soluzione a concentrazione maggiore di solvente verso quella a concentrazione minore. Questo porta allo sviluppo di una pressione detta pressione osmotica, indicata con Π, che può essere definita come la forza che deve essere applicata per impedire lo spostamento delle molecole di solvente attraverso una membrana semipermeabile.
Pressione osmotica: due soluzioni differenti separate da una membrana semipermeabile
Assieme all’innalzamento del punto di ebollizione, all’abbassamento del punto di congelamento e alla tensione di vapore, la pressione osmotica è una delle quattro proprietà colligative delle soluzioni, proprietà che dipendono solo dal numero di particelle di soluto presenti in soluzione, ioni, molecole o strutture sopramolecolari che siano, e non dalla natura delle particelle stesse o dalla loro massa.
Per soluzioni con n soluti, l’equazione che descrive la pressione osmotica è la somma dei contributi di ciascun soluto:

Π = RT(i1c1 + i2c2 + … + incn)

L’equazione è conosciuta come equazione di van ‘t Hoff, dove:

  • T è la temperatura assoluta, che è espressa in Kelvin;
  • R è la costante dei gas, pari a 8,314 J/mole K;
  • c è la concentrazione molare del soluto;
  • i è il fattore di van ‘t Hoff.

INDICE

Fattore di van ‘t Hoff

Il fattore di van ‘t Hoff è una misura del grado di dissociazione del soluto in soluzione, ed è descritto dall’equazione:

i = 1 + α(n-1)

dove:

  • α è il grado di dissociazione delle molecole di soluto, pari al rapporto tra le moli delle molecole di soluto che hanno subito dissociazione e il numero delle moli iniziali, e può assumere valori compresi tra 0, per sostanze che non si ionizzano o dissociano, ed 1, per sostanze che si ionizzano o dissociano completamente in soluzione;
  • n è il numero di ioni ottenuti dalla dissociazione completa della molecola di soluto.

Se si considerano specie non ionizzabili, come il glucosio, il glicogeno o l’amido, n = 1 e i = 1.
Per specie che in soluzione diluite si dissociano completamente, come acidi e basi forti o sali, il fattore di van ‘t Hoff è un numero intero maggiore di uno, essendo α = 1 e n pari ad almeno 2. Se ad esempio si considera il cloruro di sodio, NaCl, il cloruro di potassio, KCl, o il cloruro di calcio, CaCl2, si ha:

NaCl → Na+ + Cl
KCl → K+ + Cl
CaCl2 → Ca2+ + 2 Cl

Quindi nei primi due casi i = 2, mentre con il cloruro di calcio è pari a 3.
Infine, per sostanze che non si ionizzano completamente, come acidi e basi deboli, i non è un numero intero.

Il termine ic, il prodotto del fattore di van ‘t Hoff e la concentrazione molare del soluto, è l’osmolarità della soluzione, ossia la concentrazione delle particelle di soluto osmoticamente attive per litro di soluzione.

Pressione osmotica, osmosi e membrane cellulari

L’osmosi può essere definita come il movimento o flusso netto di un solvente attraverso una membrana semipermeabile, sotto la spinta delle differenze di pressione osmotica tra i due lati della membrana, al fine di cercare di uguagliare la concentrazione del soluto ai due lati della membrana stessa.
Nei sistemi biologici l’acqua è il solvente e le membrane plasmatiche sono le membrane semipermeabili. Le membrane plasmatiche consentono il passaggio alle molecole d’acqua, grazie alla presenza di canali proteici, le acquaporine, nonché a piccole molecole non polari che possono diffondere rapidamente attraverso esse, mentre sono stanzialmente impermeabili a ioni e macromolecole. La presenza all’interno della cellula di macromolecole come acidi nucleici, proteine, glicogeno e aggregati sopramolecolari, ad esempio i complessi multienzimatici, ma anche ioni in concentrazione maggiore rispetto a quella dell’ambiente extracellulare, fa si che la pressione osmotica guidi l’acqua dall’esterno all’interno della cellula. Se questo flusso netto di acqua verso l’interno della cellula non fosse controbilanciato si avrebbe in breve una distensione della membrana plasmatica tale da comportarne la rottura, ossia la cellula scoppierebbe a causa di un eccesso di acqua al suo interno, si verificherebbe cioè una lisi osmotica. In condizioni fisiologiche questo non avviene in quanto nel corso dell’evoluzione si sono sviluppati diversi meccanismi che si oppongono, e in alcuni casi addirittura sfruttano, queste forze osmotiche. Due di questi sono le pompe ioniche energia dipendenti e, nei batteri, nei fungi e nelle cellule vegetali, la parete cellulare.

Pompe ioniche energia dipendenti

Le pompe ioniche riducono, con spesa di ATP, le concentrazioni intracellulari di determinati ioni rispetto alle loro concentrazioni nell’ambiente extracellulare, creando quindi una ineguale distribuzione degli ioni stessi sui due lati della membrana plasmatica, ossia creando un gradiente ionico. In questo modo la cellula controbilancia le forze osmotiche dovute agli ioni e macromolecole intrappolate al suo interno. Un esempio di pompa ionica energia dipendente è la Na+/K+ ATPasi, che riduce la concentrazione intracellulare di Na+ rispetto all’esterno della cellula.

Parete cellulare

Le cellule vegetali sono circondate da una matrice extracellulare, la parete cellulare, che, essendo non espandibile e posizionata in prossimità della membrana plasmatica, permette alla cellula di resistere alle forze osmotiche che potrebbero causarne il rigonfiamento e infine la lisi. In che modo? Nelle cellule vegetali mature i vacuoli sono gli organelli di dimensioni maggiori, arrivando ad occupare circa l’80% del volume cellulare. Al loro interno vengono accumulate grandi quantità di soluti, per la maggior parte acidi organici ed inorganici, i quali osmoticamente richiamano acqua, il che determina il rigonfiamento del vacuolo stesso. A sua volta questo fa si che il tonoplasto, la membrana che circonda l’organello, spinga la membrana plasmatica contro la parete cellulare, la quale, opponendosi meccanicamente a queste forze, permette di evitare la lisi osmotica. Questa pressione osmotica è chiamata pressione di turgore e può raggiungere le 20 atmosfere, 2 MPa, un valore circa 10 volte maggiore rispetto alla pressione dei pneumatici. La pressione di turgore è responsabile della rigidità delle parti non legnose delle piante, è coinvolta nella crescita della pianta, nonchè:

  • nell’avvizzimento della verdura, a seguito di una sua riduzione;
  • nei movimenti delle piante, quali:
    • i movimenti circadiani delle foglie;
    • i movimenti delle foglie della Dionaea muscipula, una pianta carnivora, o delle foglie delle Mimosa pudica.

Anche nei batteri e funghi la membrana plasmatica è circondata da una parete cellulare sufficientemente rigida e non espandibile da impedire la lisi osmotica della cellula.

Soluzioni isotoniche, ipotoniche ed ipertoniche

Dal confronto tra la pressione osmotica di sue soluzioni separate da una membrana semipermeabile è possibile definire tre tipi di soluzioni, di seguito brevemente descritte.

  • Due soluzioni che abbiano la stessa pressione osmotica sono definite isotoniche.
  • Se due soluzioni hanno differenti pressione osmotica, quella a pressione maggiore viene definita ipertonica rispetto all’altra.
  • Se due soluzioni hanno differenti pressioni osmotiche, quella a pressione minore viene definita ipotonica rispetto all’altra.

Nei sistemi biologici la soluzione di riferimento è rappresentata dal citosol; quindi, ponendo una cellula in una soluzione:

  • isotonica, non si avrà trasferimento netto di acqua tra l’interno e l’esterno della cellula stessa;
  • ipertonica, sia avrà un trasferimento netto di acqua dalla cellula verso l’esterno, la cellula perde acqua e si raggrinzisce;
  • ipotonica, si verifica un trasferimento netto di acqua al suo interno, la cellula si rigonfia e può arrivare a scoppiare, ossia si può verificare una lisi osmotica.

In aggiunta alle pompe ioniche e alla parete cellulare, nel corso dell’evoluzione gli organismi pluricellulari hanno sviluppato un’altra soluzione per opporsi alle forze osmotiche: circondare le cellule con soluzioni isotoniche o prossime all’isotonicità che impediscano o comunque limitino un influsso o un efflusso netto di acqua. Un esempio è il plasma, ossia il sangue privato della componente cellulare, che, grazie alla presenza di sali e proteine, nell’uomo principalmente l’albumina, ha un’osmolarità simile a quella presente nel citosol.

Pressione osmotica, amido e glicogeno

Gli organismi immagazzinano glucosio non in forma libera ma come polimeri, glicogeno gli animali, i funghi ed i batteri, amido le piante, in questo modo evitando che la pressione osmotica esercitata dalle riserve di carboidrati diventi troppo grande. Infatti, dato che la pressione osmotica, al pari delle altre proprietà colligative, dipende solo dal numero delle molecole di soluto, immagazzinare milioni di molecole di glucosio in forma di un numero notevolmente inferiore di polisaccaridi permette di evitarne un aumento abnorme. Di seguito alcuni esempi.

  • Se si considera un polisaccaride, come il glicogeno o amido, formato da 1000 unità di glucosio e del peso di un grammo, questi ha un effetto sulla pressione osmotica inferiore a quello di un milligrammo di glucosio libero.
  • Considerando un epatocita, se il glucosio immagazzinato in forma di glicogeno fosse presente come glucosio libero, la sua concentrazione sarebbe di circa 0,4 M, contro una concentrazione del glicogeno di circa 0,04 μM. Questo causerebbe un flusso netto di acqua verso l’interno della cellula tale da portare a lisi osmotica.
    Inoltre, se anche si riuscisse ad evitare la lisi osmotica, si avrebbero problemi riguardo al trasporto del glucosio all’interno della cellula. Nell’uomo, in condizioni fisiologiche, la concentrazione ematica del glucosio è compresa nell’intervallo 3,33-5,56 mmol/L o 60-100 mg/dL; se il glucosio fosse immagazzinato in forma libera la sua concentrazione intracellulare sarebbe da 120 a 72 volte maggiore di quella sanguigna, e il suo trasporto nell’epatocita comporterebbe un grande dispendio energetico.

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Nelson D.L., Cox M.M. Lehninger. Principles of biochemistry. 6th Edition. W.H. Freeman and Company, 2012

Enzimi multifunzionali

Gli enzimi multifunzionali sono proteine in cui due o più siti attivi che catalizzano reazioni consecutive di una via metabolica sono presenti in una catena polipeptidica. Sembra probabile che derivino da eventi di fusione genica rappresentando, al pari dei complessi multienzimatici, una soluzione adottata dall’evoluzione per massimizzare l’efficienza catalitica, assicurando vantaggi che non si avrebbero nel caso in cui le singole attività enzimatiche fossero presenti su proteine distinte e libere.

INDICE

Quali vantaggi offrono gli enzimi multifunzionali?

Gli organismi viventi combattono con l’inevitabile processo di decadimento che, se non contrastato, conduce ad un crescente aumento del disordine, sino alla morte. A livello molecolare il mantenimento della vita è reso possibile dalla grande efficienza raggiunta dagli enzimi nell’accelerare le reazioni chimiche e nell’evitare reazioni collaterali. Un’idea della velocità con cui procede il metabolismo cellulare è fornita dalla velocità del turn over dell’ATP in una cellula di mammifero: ogni 1-2 minuti l’intero pool del trifosfato è idrolizzato e risintetizzato. Tradotto in numeri questo corrisponde al turn over di circa 107 molecole di ATP al secondo, e, per il corpo umano, a circa 1 grammo di ATP al minuto. Alcuni enzimi hanno addirittura raggiunto la perfezione catalitica, ossia sono talmente efficienti che quasi ogni collisione con il proprio substrato porta alla catalisi.
Enzimi multifunzionaliE uno dei fattori limitanti la velocità di una reazione enzimatica è la proprio frequenza con cui enzimi e substrati collidono. Il modo più semplice per aumentare la frequenza delle collisioni sarebbe quello di aumentare la concentrazione di substrati ed enzimi. Tuttavia, dato l’elevatissimo numero di differenti reazioni che avvengono all’interno della cellula, questa strada non è praticabile. Esiste cioè un limite alle concentrazioni che substrati ed enzimi possono raggiungere, concentrazioni che sono dell’ordine delle micromoli per i substrati, e anche più basse per gli enzimi. Fanno eccezione gli enzimi della glicolisi nelle cellule muscolari e negli eritrociti, presenti in concentrazioni dell’ordine delle 0.1 mM e anche maggiori.
Una delle strade percorse dall’evoluzione per aumentare la velocità con cui procedono le reazioni enzimatiche è stata quella di selezionare strutture molecolari, quali gli enzimi multifunzionali ed i complessi multienzimatici, che permettano, attraverso l’ottimizzazione dell’organizzazione spaziale degli enzimi di una via metabolica, di minimizzare la distanza che il prodotto della reazione A deve percorrere per raggiungere il sito attivo che catalizza la reazione successiva B, e così via, ottenendo cioè l’incanalamento dei substrati della via stessa. Per alcuni enzimi multifunzionali e complessi multienzimatici l’incanalamento è ottenuto grazie alla presenza di veri e propri tunnel intramolecolari. L’incanalamento dei substrati migliora l’efficienza catalitica, e quindi la velocità di reazione, in vari modi, di seguito brevemente descritti.

  • Minimizza la diffusione nel mezzo circostante del reagente, quindi la sua diluizione, permettendo così di raggiungere concentrazioni locali elevate, anche quando la sua concentrazione nella cellula è bassa, aumentando quindi la frequenza delle collisioni enzima-substrato.
  • Riduce il tempo di transito dei substrati da un sito attivo al successivo.
  • Minimizza la probabilità che si verifichino reazioni collaterali.
  • Minimizza la probabilità che intermedi chimicamente labili siano degradati.

Gli enzimi multifunzionali offrono vantaggi anche dal punto di vista della regolazione della loro sintesi, essendo possibile coordinare la sintesi di tutte le attività enzimatiche interessate grazie al fatto che la struttura è codificata da un singolo gene.

Infine, analogamente ai complessi multienzimatici, è possibile regolare in modo coordinato le attività enzimatiche presenti. Se a questo si aggiunge che spesso l’enzima che catalizza la tappa di comando della sequenza è quello che catalizza la prima reazione, è possibile sia evitare la sintesi di molecole non necessarie, che sarebbero invece prodotte se la tappa di comando fosse a valle della prima reazione, come pure uno spreco di energia e la sottrazione di metaboliti ad altre vie metaboliche.

Esempi di enzimi multifunzionali

Al pari dei complessi multienzimatici, anche gli enzimi multifunzionali sono molto comuni e coinvolti in vie metaboliche sia anaboliche che cataboliche.
Di seguito alcuni esempi.

Acetil-CoA carbossilasi

L’acetil-CoA carbossilasi o ACC (EC 6.4.1.2), una carbossilasi biotina-dipendente, è formata da due enzimi, la biotina carbossilasi (EC 6.3.4.14) e una transcarbossilasi, più la proteina trasportatrice della biotina o BCCP, acronimo dell’inglese biotin carboxyl-carrier protein. ACC catalizza la sintesi del malonil-CoA via carbossilazione dell’acetil-CoA. La reazione, che rappresenta la tappa di comando della sintesi degli acidi grassi, procede in due tappe. Nella prima la biotina carbossilasi catalizza il trasferimento di una molecola di anidride carbonica (CO2) dallo ione bicarbonato ad un atomo di azoto dell’anello della biotina, che funge da trasportatore temporaneo di CO2. La reazione comporta il consumo di una molecola di ATP. Nella seconda tappa la transcarbossilasi catalizza il trasferimento del gruppo carbossilico dalla carbossi-biotina all’acetil-CoA a dare malonil-CoA. Il malonil-CoA verrà di seguito utilizzato come donatore di unità bicarboniose dalla acido grasso sintasi (EC 2.3.1.85) durante l’allungamento degli acidi grassi.
Nei mammiferi e negli uccelli l’acetil-CoA carbossilasi è un enzima multifunzionale essendo le due attività enzimatiche, e BCCP, presenti su un’unica catena polipeptidica. Nei batteri invece ACC è un complesso multienzimatico formato dall’aggregazione di tre catene polipeptidiche, ossia i due enzimi più BCCP.
Nelle piante superiori sono presenti entrambe le forme.

Acido grasso sintasi di tipo I

L’acido grasso sintasi o FAS, acronimo dell’inglese fatty acid synthase, catalizza la sintesi dell’acido palmitico utilizzando il malonil-CoA, che è il prodotto della reazione catalizzata dalla acetil-CoA carbossilasi, come donatore di unità bicarboniose.
Esistono due tipi di acido grasso sintasi.
Negli animali e nei funghi è un enzima multifunzionale, ed è detto di tipo I. Negli animali è un omodimero, ed in ogni catena polipeptidica sono presenti le sette le attività enzimatiche e la proteina trasportatrice di acili o ACP, acronimo dell’inglese acyl carrier protein. Nei lieviti e nei funghi FAS è formata da due subunità multifunzionali, dette α and β, disposte a formare una struttura eterododecamerica α6β6.
Nella maggior parte dei procarioti e nelle piante l’acido grasso sintasi, detta di tipo II, non è un enzima multifunzionale ma un complesso multienzimatico essendo composto da enzimi distinti più  ACP.

PRA isomerasi:IGP sintasi

La sintesi dell’aminoacido triptofano a partire dal corismato coinvolge diversi passaggi, di seguito brevemente descritti.
Nel primo, la glutammina dona un atomo di azoto all’anello indolico del corismato, che è convertito in antranilato, e la glutammina in glutammato; la reazione è catalizzata dalla antranilato sintasi (EC 4.1.3.27). L’antranilato è fosforibosilato a spese del 5-fosforibosil-1-pirofosfato o PRPP, acronimo dell’inglese 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate, a dare N-(5’-fosforibosil)-antranilato o PRA, acronimo dell’inglese N-(5′-phosphoribosyl)-anthranilate, nella reazione catalizzata dalla antranilato fosforibosiltransferasi (EC 2.4.2.18). Nel passaggio successivo, catalizzato dalla PRA isomerasi (EC 5.3.1.24), PRA è isomerizzato a dare enol-1-o-carbossifenilamino-1-desossiribulosio fosfato o CdRP, acronimo dell’inglese enol-1-o-carboxyphenylamino-1-desoxyribulose phosphate. CdRP, è convertito in indolo-3-glicerolo fosfato o IGP, acronimo dell’inglese indole-3-glycerol phosphate, nella reazione catalizzata dalla indolo-3-glicerofosfato sintasi o IGP sintasi (EC 4.1.1.48). Infine, la triptofano sintasi (EC 4.2.1.20) catalizza gli ultimi due passaggi della via: la conversione di IGP in indolo, una idrolisi, e la reazione dell’indolo con una serina a dare il triptofano.
In E. coli, PRA isomerasi e IGP sintasi sono presenti su un’unica catena polipeptidica, che è quindi un enzima bifunzionale. In altri microorganismi, come Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium e Pseudomonas putida le due attività enzimatiche sono presenti su catene polipeptidiche distinte.
La triptofano sintasi è invece un esempio di complesso multienzimatico, ed uno degli esempi meglio caratterizzati di canalizzazione del flusso dei metaboliti.

Glutammina-PRPP amido transferasi

La glutammina-PRPP ammidotransferasi (EC 2.4.2.14) catalizza la prima della 10 tappe che portano alla sintesi de novo delle purine, ossia la formazione della 5-fosforibosilammina a seguito del trasferimento dell’azoto ammidico della glutammina, che funge quindi da fonte di azoto, al PRPP.
La reazione procede in due tappe, catalizzate nei due siti attivi dell’enzima, un sito N-terminale ed uno C-terminale. Nella prima tappa, il sito attivo N-terminale catalizza l’idrolisi dell’azoto ammidico della glutammina a dare ammoniaca e glutammato. Nella seconda tappa, catalizzata dal sito attivo C-terminale, che ha attività fosforibosiltransferasica, l’ammoniaca precedentemente rilasciata viene legata al C-1 del PRPP a dare la 5-fosforibosilammina. In questa reazione si verifica l’inversione della configurazione del C-1 del ribosio, da α a β, stabilendo la forma anomerica del nucleotide in via di sintesi.
Ci sono tre punti di controllo che cooperano nella regolazione della sintesi de novo dei nucleotidi purinici, e la reazione catalizzata dalla glutammina-PRPP ammidotransferasi, che è anche la prima reazione esclusiva della via, è il primo.
Al pari del complesso della carbamil fosfato sintetasi batterica, anche i siti attivi di questo enzima multifunzionale sono connessi attraverso un canale intramolecolare. Tuttavia questo canale è più corto, essendo lungo circa 20 Å, ed è delimitato da residui amminoacidici non polari, quindi è altamente idrofobico. Mancando gruppi in grado di stabilire legami idrogeno, il tunnel permette la diffusione dell’ammoniaca verso il secondo sito attivo.

CAD

La sintesi de novo dei nucleotidi pirimidinici avviene attraverso una serie di reazioni enzimatiche che, a differenza di quanto accade nella sintesi de novo dei nucleotidi purinici, comporta dapprima la formazione dell’anello pirimidinico e quindi il suo legame al ribosio-5-fosfato. Le prime tre tappe della via sono catalizzate in sequenza dalla carbamil fosfato sintetasi (EC 6.3.4.16), aspartato transcarbamilasi (EC 2.1.3.2) e diidroorotasi (EC 3.5.2.3), e sono comuni a tutte le specie.
Nella prima tappa, la carbamil fosfato sintetasi, che presenta due attività enzimatiche, ossia una attività amidotransferasica glutammina dipendente ed un’attività sintasica, catalizza la sintesi del carbamil fosfato a partire da glutammina, ione bicarbonato ed ATP. Nella seconda tappa, che è quella di comando della via metabolica ed è catalizzata dalla aspartato transcarbamilasi, il carbamil fosfato reagisce con l’aspartato a dare l’N-carbamil aspartato. Infine la diidroorotasi, catalizzando la rimozione di una molecola d’acqua dall’N-carbamil aspartato, porta alla chiusura dell’anello pirimidinico a formare L-diidroorotato.
Negli eucarioti, in particolare nei mammiferi, in Drosofila e Dictyostelium, un genere di amebe, le tre attività sono presenti su una singola catena polipeptidica, codificata da un singolo gene derivante da una fusione avvenuta almeno 100 milioni di anni fa. L’enzima multifunzionale, abbreviato come CAD, è un omomultimero composto da tre subunità o più.
Nei procarioti invece i tre enzimi sono indipendenti, e la carbamil fosfato sintetasi è un esempio di complesso multienzimatico.
Nei lieviti l’attività diidroorotasica è presente su una proteina separata.
Studi sull’attività enzimatica hanno rivelato l’esistenza di un incanalamento dei substrati, più efficace nella proteina del lievito, riguardo ai primi due passaggi, rispetto a quella dei mammiferi.

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Yon-Kahn J., Hervé G. Molecular and cellular enzymology. Springer, 2009 [Google eBook]

Complessi multienzimatici

I complessi multienzimatici sono strutture discrete e stabili formate da enzimi associati in modo non covalente che catalizzano due o più reazioni consecutive di una via metabolica.
Possono essere considerati come un passo in avanti nell’evoluzione dell’efficienza catalitica in quanto assicurano vantaggi che i singoli enzimi, anche quelli che hanno raggiunto la perfezione catalitica, da soli non avrebbero.

INDICE

Quali vantaggi offrono i complessi multienzimatici?

Nel corso dell’evoluzione alcuni enzimi si sono evoluti sino al raggiungimento della perfezione catalitica. Si tratta cioè di enzimi per i quali quasi ogni collisione con il proprio substrato ne determina la conversione in prodotto. Esempi sono:

  • la fumarasi (EC 4.2.1.2), che catalizza la settima tappa del ciclo dell’acido citrico, ossia l’idratazione/deidratazione reversibile del doppio legame del fumarato a dare malato;
  • l’acetilcolinesterasi (EC 3.1.1.7), che catalizza l’idrolisi dell’acetilcolina, un neurotrasmettitore, in colina e acido acetico, che a sua volta si dissocia a dare acetato e ioni idrogeno;
  • la superossido dismutasi (EC 1.15.1.1), che catalizza la conversione, e quindi l’inattivazione, del radicale superossido (O2.-), una specie molto reattiva, in perossido d’idrogeno od acqua ossigenata (H2O2) ed acqua;
  • la catalasi (EC 1.11.1.6), che catalizza la degradazione di H2O2 in acqua ed ossigeno.

La velocità con cui avviene una reazione enzimatica è dunque in parte è determinata dalla frequenza con cui i substrati e gli enzimi stessi collidono. Ne deriva che un modo semplice per aumentarla sia quello di aumentare le concentrazioni di enzima e substrato. Tuttavia, visto l’enorme numero di reazioni che si verificano all’interno della cellula le loro concentrazioni non potranno essere elevate. Ed infatti nella cellule la concentrazione della maggior parte dei metaboliti è dell’ordine delle micromoli (10-6 M), e per la maggior parte degli enzimi anche più bassa.
L’evoluzione ha quindi imboccato strade differenti per aumentare la velocità di reazione, una delle quali è stata quella di ottimizzare l’organizzazione spaziale degli enzimi con la formazione dei complessi multienzimatici e degli enzimi multifunzionali, ossia strutture che permettono di minimizzare la distanza che il prodotto di una reazione deve percorrere per passare al sito attivo che catalizza la reazione successiva, essendo i siti attivi vicini gli uni agli altri. Si verifica cioè l’incanalamento dei substrati, in inglese substrate o metabolic channeling, incanalamento che può avvenire anche attraverso veri e propri canali intramolecolari che connettono i siti attivi, come nel caso, tra i complessi enzimatici, del complesso della triptofano sintasi (EC 4.2.1.20), il cui tunnel fu il primo ad essere scoperto, e quello della carbamil fosfato sintetasi batterica (EC 6.3.4.16).
L’incanalamento dei substrati è in grado di aumentare la velocità di reazione, ma più in generale l’efficienza catalitica, in più modi, di seguito brevemente descritti.

  • Viene limitata al minimo la diffusione di substrati e prodotti nel mezzo circostante, quindi la loro diluizione e riduzione della concentrazione, producendo anzi elevate concentrazioni locali anche quando la loro concentrazione cellulare è bassa, il che porta ad un aumento della frequenza delle collisioni enzima-substrato.
  • Viene ridotto il tempo di transito dei substrati da un sito attivo al sito attivo successivo.
  • Viene ridotta la probabilità che si verifichino reazioni collaterali.
  • Gli intermedi chimicamente labili sono protetti dalla degradazione da parte del solvente.

Un altro vantaggio metabolico apportato dai complessi multienzimatici, analogamente a quanto accade con gli enzimi multifunzionali, è che consentono di controllare in modo coordinato l’attività catalitica degli enzimi che lo compongono. E se si aggiunge il fatto che spesso l’enzima che catalizza la prima reazione della sequenza è l’enzima regolatorio, è possibile evitare:

  • la sintesi di intermedi non necessari, altrimenti prodotti se la sequenza di reazioni fosse regolata a valle della prima reazione;
  • la sottrazione di metaboliti ad altre vie come pure uno spreco di energia.

Esempi di complessi multienzimatici

Da quanto detto in precedenza non sorprende che, specialmente nelle cellule eucariote, i complessi multienzimatici, al pari degli enzimi multifunzionali, siamo comuni e coinvolti in differenti vie metaboliche, sia anaboliche che cataboliche, mentre sono pochi gli enzimi liberamente diffusibili. Di seguito alcuni esempi.

Alfa-chetoacido deidrogenasi

Esempi classici di complessi multienzimatici sono i tre complessi appartenenti alla famiglia delle alfa-chetoacido deidrogenasi o 2-ossiacido deidrogenasi, ossia:

  • il complesso della piruvato deidrogenasi o PDC, acronimo dell’inglese pyruvate dehydrogenase complex;
  • il complesso dell’α-chetoacido deidrogenasi a catena ramificata o BCKDH , acronimo dell’inglese branched-chain α-keto acid dehydrogenase complex;
  • il complesso della α-chetoglutarato deidrogenasi, o 2-oxoglutarato deidrogenasi o OGDH, acronimo dell’inglese 2-oxoglutarate dehydrogenase.

I tre complessi sono correlati sia dal punto di vista strutturale che funzionale.
Considerando ad esempio il complesso della piruvato deidrogenasi questi è formato da copie multiple di tre enzimi differenti:

  • piruvato deidrogenasi o E1 (EC 1.2.4.1);
  • diidrolipoil transacetilasi o E2 (EC 2.3.1.12);
  • diidrolipoil deidrogenasi o E3 (EC 1.8.1.4).

PDC, sia nei procarioti che negli eucarioti presenta quindi una struttura di base E1-E2-E3, struttura che si ritrova anche negli altri due complessi. In aggiunta, all’interno di una data specie:

  • la diidrolipoil deidrogenasi è identica;
  • la piruvato deidrogenasi e la diidrolipoil transacetilasi sono omologhe

E, sebbene questi enzimi siamo specifici per i rispettivi substrati,  utilizzano gli stessi cofattori, ossia il coenzima A, il NAD, al tiamina pirofosfato, il FAD e la lipoamide.
Al fine di differenziarle vengono indicate, per il complesso della piruvato deidrogenasi, della α-chetoglutarato deidrogenasi e della α-chetoacido deidrogenasi a catena ramificata, rispettivamente come:

  • E1p, E1o ed E1b (EC 1.2.4.4);
  • E3p, E3o, and E3b (EC 1.8.1.4).

Nota: il complesso della piruvato deidrogenasi degli eucarioti è il più grande complesso multienzimatico conosciuto, più grande di un ribosoma e visibile anche al microscopio elettronico.

Il complesso della piruvato deidrogenasi, che rappresenta il ponte di collegamento tra glicolisi e ciclo dell’acido citrico, catalizza la decarbossilazione ossidativa del piruvato, un α-chetoacido. Nel corso delle reazioni il gruppo carbossilico del piruvato viene rilasciato in forma di anidride carbonica (CO2) e si verifica il trasferimento del gruppo acetilico risultante al coenzima A a dare acetil-coenzima A. Inoltre sono rilasciati due elettroni che sono trasferiti al NAD+.

Complessi Multienzimatici
Fig. 1 – Le Cinque Reazioni Catalizzate da PDC

Anche nel corso delle reazioni catalizzate dal complesso della α-chetoglutarato deidrogenasi e dal complesso della α-chetoacido deidrogenasi a catena ramificata, rispettivamente quarta reazione del ciclo dell’acido citrico, ossia l’ossidazione dell’α-chetoglutarato a succinil-CoA, e l’ossidazione degli α-chetoacidi derivanti dal catabolismo degli amminoacidi a catena ramificata valina, leucina ed isoleucina, si verifica:

  • la liberazione del carbonio carbossilico dell’alfa-chetoacido in forma di CO2;
  • il trasferimento del gruppo acilico risultante al coenzima A a dare l’acil-CoA corrispondente;
  • la riduzione del NAD+ a NADH.

Dunque, la notevole somiglianza esistente tra le strutture proteiche, i cofattori richiesti ed i meccanismi di reazione riflettono senza dubbio una origine evolutiva comune.

Che cosa sono i chetoacidi?

I chetoacidi o ossiacidi sono composti organici contenenti due gruppi funzionali: un gruppo carbossilico ed uno chetonico. In base alla posizione del gruppo chetonico si possono individuare alfa-chetoacidi, beta-chetoacidi e gamma-chetoacidi.

  • Negli alfa-chetoacidi o 2-ossiacidi il gruppo chetonico è in posizione α (2) rispetto al carbonio carbossilico, ossia adiacente ad esso. Questi composti sono particolarmente importanti in biologia in quanto coinvolti nella glicolisi, l’acido piruvico, il più semplice degli α-chetoacidi, e nel ciclo dell’acido citrico, l’acido ossalacetico e l’acido α-chetoglutarico.
  • Nei beta-chetoacidi o 3-ossiacidi il gruppo chetonico è in posizione β (3) rispetto al carbonio carbossilico. Un esempio è l’acido acetoacetico, il più semplice tra i β-chetoacidi, e uno dei tre corpi chetonici, assieme all’acetone e l’acido β-idrossibutirrico, prodotti dall’epatocita nel caso in cui ci sia un eccesso di acetil-CoA, come durante il digiuno o diete povere di carboidrati.
  • Nei gamma-chetoacidi o 4-ossiacidi il gruppo chetonico è in posizione γ (4) rispetto al carbonio carbossilico. Un esempio è l’acido levulinico, il più semplice dei γ-chetoacidi, derivante dal catabolismo della cellulosa.
Chetoacidi
Fig. 2 – Chetoacidi

Triptofano sintasi

Il complesso della triptofano sintasi è uno degli esempi di incanalamento dei substrati meglio studiati. Presente nei batteri e nelle piante ma non negli animali, nei batteri è formato da due subunità α e due β assemblate in unità dimeriche αβ, che sembrano esser l’unità funzionale del complesso, a dare una struttura tetramerica αββα.
Il complesso catalizza gli ultimi due passaggi della sintesi del triptofano: dall’indolo-3-glicero fosfato, per azione di una liasi (EC 4.1.2.8) presente sulle subunità α, viene liberata una molecola di gliceraldeide-3-fosfato e l’indolo. L’indolo diffonde quindi verso il sito attivo presente sulla subunità β sfruttando un tunnel idrofobico di circa 30 Å che, in ciascuna coppia αβ, connette i due siti attivi. Nel sito attivo della subunità β avviene, in presenza del piridossal-5-fosfato, la condensazione tra l’indolo ed una serina a dare il triptofano.

Acetil-CoA carbossilasi

L’acetil-CoA carbossilasi o ACC (EC 6.4.1.2), membro della famiglia delle carbossilasi biotina-dipendenti, catalizza la prima tappa di comando della sintesi degli acidi grassi, ossia la carbossilazione dell’acetil-CoA a malonil-CoA, che è utilizzato come donatore di unità bicarboniose dalla acido grasso sintasi (EC 2.3.1.85) durante il processo di allungamento che porterà alla sintesi dell’acido palmitico.
Nei batteri ACC è un complesso multienzimatico composto da due enzimi, la biotina carbossilasi (EC 6.3.4.14) e una carbossitransferasi, cui si aggiunge una proteina trasportatrice della biotina o BCCP, acronimo dell’inglese biotin carboxyl-carrier protein.
Nei mammiferi e negli uccelli è invece un enzima multifunzionale, in quanto le due attività enzimatiche sono presenti su una stessa catena polipeptidica, nella quale si ritrova anche BCCP.
Nelle piante superiori sono presenti entrambe le forme.

Carbamil fosfato sintetasi

Altro esempio ben caratterizzato di incanalamento dei substrati è il complesso della carbamil fosfato sintetasi dei batteri, che catalizza la sintesi del carbamil fosfato, necessario sia per la sintesi delle pirimidine che per quella dell’arginina. Il complesso presenta un tunnel lungo circa 100 Å all’interno del quale si muovono i prodotti delle sue tre attività enzimatiche.
La prima catalizza la cessione dell’azoto ammidico della glutammina in forma di ione ammonio, il quale entra nel tunnel dove nel secondo sito attivo si combina con il bicarbonato, a spese di una molecola di ATP, a dare carbamato, che infine nell’ultimo sito attivo viene fosforilato a carbamil fosfato.

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Complesso della piruvato deidrogenasi: struttura, reazioni e regolazione

Il complesso della piruvato deidrogenasi o PDC, acronimo dell’inglese pyruvate dehydrogenase complex, è un complesso multienzimatico mitocondriale composto da tre differenti enzimi:

  • piruvato deidrogenasi o E1 (EC 1.2.4.1);
  • diidrolipoil transacetilasi o E2 (EC 2.3.1.12);
  • diidrolipoil deidrogenasi o E3 (EC 1.8.1.4).

Ognuno di questi enzimi è presente in più copie il cui numero, e quindi le dimensioni del complesso stesso, varia da specie a specie, con una massa molecolare che oscilla da 4 a 10 milioni di Dalton.

Fanno parte del complesso multienzimatico anche:

  • cinque differenti coenzimi;
  • nelle piante, nei funghi e, tra gli animali, nei volatili e nei mammiferi, due enzimi con attività regolatoria: la piruvato deidrogenasi chinasi (EC 2.7.1.99), enzima Mg2+-dipendente, e la piruvato deidrogenasi fosfatasi) (EC 3.1.3.43), enzima attivato dagli ioni calcio (Ca2+);
  • negli eucarioti, una proteina con funzione di legame, E3BP.

Il complesso della piruvato deidrogenasi catalizza, attraverso una sequenza di cinque reazioni, la decarbossilazione ossidativa del piruvato, un α-chetoacido, a dare il gruppo il gruppo acetilico dell’acetil-coenzima A o acetil-CoA, una molecola di CO2, e due elettroni trasportati dal NAD. La stechiometria complessiva della sequenza delle cinque reazioni è:

Complesso della Piruvato Deidrogenasi
Fig. 1 – PDC: Reazione Complessiva

La reazione complessiva è essenzialmente irreversibile, con un ΔG°’ pari a -8,0 kcal/mol (-33,4 kJ/mol), e richiede l’intervento sequenziale di tutti e tre gli enzimi, le cui attività risultano coordinate. Nel corso delle reazioni i prodotti intermedi rimangono legati agli enzimi e al termine della sequenza catalitica il complesso multienzimatico è pronto per il ciclo successivo.

Complesso della Piruvato Deidrogenasi
Fig. 2 – Le Cinque Reazioni Catalizzate da PDC

Nota: il complesso della piruvato deidrogenasi catalizza le stesse reazioni attraverso meccanismi simili in tutti gli organismi in cui è presente.

INDICE

I coenzimi del complesso della piruvato deidrogenasi

Cinque coenzimi partecipano alle reazioni catalizzate dal complesso della piruvato deidrogenasi: la tiamina pirofosfato o TPP, acronimo dell’inglese thiamine pyrophosphate, la flavina adenina dinucleotide o FAD, il coenzima A o CoA, la nicotinammide adenina dinucleotide o NAD, e l’acido lipoico.

  • La tiamina pirofosfato deriva dalla tiamina o vitamina B1 di cui rappresenta la forma biologicamente attiva.
    Tiamina Pirofosfato
    Fig. 3 – TPP

    TPP è il coenzima della piruvato deidrogenasi cui è strettamente, ma non covalentemente, legata. Il suo ruolo è quello di trasportatore di gruppi idrossietilici o “aldeidici attivati”.

  • La flavina adenina dinucleotide deriva dalla riboflavina o vitamina B2, di cui rappresenta una delle forme attive; l’altra è la flavina mononucleotide o FMN.
    Flavina Adenina Dinucleotide
    Fig. 4 – FAD

    Il FAD è il coenzima della diidrolipoil deidrogenasi cui è saldamente legato. Il suo ruolo, analogamente al NAD, è quello di trasportatore di elettroni o ioni idruro (:H o H+ + 2e).

  • Il coenzima A è formato da una β-mercaptoetilamina legata attraverso legame ammidico all’acido pantotenico o vitamina B5, che a sua volta è unito, attraverso un ponte pirofosfato, ad una 3’-fosfoadenosina.
    Il CoA partecipa alla reazione catalizzata dalla diidrolipoil transacetilasi. Il suo ruolo è quello di trasportatore di gruppi acilici.

    Coenzima A
    Fig. 5 – Coenzima A

    La porzione del coenzima A corrispondente alla β-mercaptoetilamina termina con un gruppo sulfidrilico (–SH), un tiolo reattivo cruciale per il ruolo svolto dal coenzima in quanto i gruppi acilici trasportati, legati attraverso un legame tioestere, hanno una elevata energia libera standard di idrolisi. Ciò fornisce loro un elevato potenziale di trasferimento, pari a -31,5 kcal/mol (-7,5 kJ/mol), che risulta addirittura più esoergonico, anche se di solo 0,2 kcal/mol (1 kJ/mol), rispetto a quello per l’idrolisi dell’ATP ad ADP e Pi. Pertanto i tioesteri hanno un elevato potenziale di trasferimento del gruppo acilico e sono in grado di donarlo a numerose molecole accettrici. In altre parole il gruppo acilico legato al coenzima A può essere considerato come una forma attivata pronta per il trasferimento. E’ anche possibile affermare che la formazione del legame tioestere permette di conservare parte dell’energia metabolica derivante dall’ossidazione del carburante metabolico. E va sottolineato che il coenzima A è anche abbreviato come CoA-SH, proprio per enfatizzare il ruolo svolto dal gruppo tiolico.
    Nota: nel legame tioestere è presente un atomo di zolfo nella posizione in cui nel legame estere è presente un atomo di ossigeno.

    Legami Tioestere ed Estere
    Fig. 6 – Legami Estere e Tioestere
  • La nicotinammide adenina dinucleotide può essere prodotta a partire dal triptofano, un aminoacido essenziale, o dalla niacina o vitamina B3 o vitamina PP, da Pellagra-Preventing, la fonte della parte nicotinammidica.
    Nicotinammide Adenina Dinucleotide
    Fig. 7 – NAD

    Il NAD è coinvolto nella reazione catalizzata dalla diidrolipoil deidrogenasi. Il suo ruolo, analogamente al FAD, è quello di trasportatore di elettroni, o ioni idruro.

  • A differenza degli altri coenzimi del complesso della piruvato deidrogenasi, l’acido lipoico non deriva, direttamente o indirettamente, da vitamine e/o aminoacidi essenziali, ossia da precursori che non possono essere sintetizzati de novo dall’organismo e devono essere assunti con la dieta.
    L’acido lipoico è il coenzima della diidrolipoil transacetilasi, cui è covalentemente legato, attraverso legame ammidico, all’ε-ammino gruppo di un suo residuo di lisina a formare un residuo di lipoil-lisina o lipoammide. Il coenzima accoppia il trasferimento di elettroni con quello di gruppi acilici.

    Complesso della Piruvato Deidrogenasi
    Fig. 8 – Lipoil-lisina

    L’acido lipoico possiede due gruppi tiolici che possono andare incontro ad ossidazione intramolecolare reversibile a dare un ponte disolfuro (-S-S-), similmente a quanto può accadere tra due residui di cisteina (Cys) di una proteina.
    Poiché il ponte disolfuro (nota: un disolfuro ciclico) può andare incontro a reazioni di ossidoriduzione, nel corso delle reazioni catalizzate dal complesso è dapprima ridotto a diidrolipoammide, un ditiolo o la forma ridotta del gruppo prostetico, e quindi riossidato nel disolfuro ciclico.

Nota
Molti enzimi necessitano per la loro attività catalitica di piccoli componenti non proteici chiamati cofattori. I cofattori possono essere ioni metallici o piccole molecole organiche o metallo-organiche e sono classificati come coenzimi e gruppi prostetici.
Un gruppo prostetico è un cofattore che si lega saldamente a un enzima con un legame non covalente o covalente, vale a dire che è legato in modo permanente alla proteina.
Un coenzima è un cofattore che non è legato in modo permanente all’enzima.

Localizzazione del complesso della piruvato deidrogenasi

Negli eucarioti il complesso della piruvato deidrogenasi, al pari degli enzimi del ciclo dell’acido citrico e di quelli per l’ossidazione degli acidi grassi, si trova nel mitocondrio, associato alla superficie della membrana mitocondriale interna che guarda la matrice.
Nei procarioti si trova nel citosol.

Funzioni del complesso della piruvato deidrogenasi

Il complesso della piruvato deidrogenasi ha essenzialmente due funzioni: produrre acetil-CoA e NADH.

Acetil-CoA
Fig. 9- Acetil-CoA
  • Il gruppo acetilico legato al coenzima A, un acetato attivato, a seconda delle condizioni metaboliche della cellula e/o del tipo di cellula, potrà essere:

ossidato a due molecole di anidride carbonica attraverso le reazioni del ciclo dell’acido citrico, il che permette la “raccolta” di una parte dell’energia potenziale immagazzinata in forma di ATP o GTP;
utilizzato per la sintesi di acidi grassi, colesterolo, steroidi, isoprenoidi, corpi chetonici e acetilcolina.

E’ quindi possibile affermare che, a seconda delle condizioni metaboliche e/o del tipo di cellula, il complesso della piruvato deidrogenasi indirizza intermedi carboniosi dal catabolismo degli aminoacidi e del glucosio verso:

il ciclo dell’acido citrico, e quindi la produzione di energia, come ad esempio nel muscolo scheletrico in condizioni aerobiche, e, sempre, nel muscolo cardiaco;
la sintesi dei lipidi e di acetilcolina.

  • Negli organismi aerobi il NADH potrà essere ossidato a NAD+ a seguito della cessione di uno ione idruro alla catena di trasporto degli elettroni mitocondriale che, a sua volta, trasferisce i due elettroni all’ossigeno molecolare (O2), trasferimento che permette la produzione di 2,5 molecole di ATP per coppia di elettroni.
    Complesso della Piruvato Deidrogenasi
    Fig. 10 – Anello Nicotinammidico: Forma Ridotta

    Nota: negli organismi anaerobi è presente un accettore di elettroni alternativo all’ossigeno, come ad esempio un nitrato o un solfato.

Dal punto di vista concettuale il complesso della piruvato deidrogenasi rappresenta il ponte di collegamento tra glicolisi e ciclo dell’acido citrico. Tuttavia, vista l’irreversibilità della reazione complessiva catalizzata dal complesso, questo ponte è “a senso unico”: il piruvato può essere decarbossilato, ossidato e l’unità acetilica rimanente legata al CoA, ma non è possibile compiere il percorso inverso, ossia convertire acetil-CoA in piruvato.
L’irreversibilità di questa reazione e l’assenza di vie metaboliche alternative spiega perché non è possibile utilizzare l’acetil-CoA, e quindi gli acidi grassi, per la gluconeogenesi (vedi sotto).

Altre fonti di acetil-CoA

Il gruppo acetilico dell’acetil-CoA può derivare, oltre che dal piruvato, dall’ossidazione degli acidi grassi e dal catabolismo di molti aminoacidi. Tuttavia, a prescindere dalla sua origine, l’acetil-CoA rappresenta un veicolo di ingresso di nuove unità carboniose nel ciclo dell’acido citrico. E’ anche possibile affermare che il gruppo acetilico dell’acetil-CoA rappresenta la forma in cui la maggior parte del carbonio entra nel ciclo.

Fonti di piruvato

Il piruvato può derivare da diverse fonti citosoliche.

  • In condizioni fisiologiche nella maggior parte delle cellule deriva principalmente dalla glicolisi: dall’ossidazione di una molecola di glucosio se ne vengono a formare due di piruvato.
  • Il lattato, nella reazione catalizzata dalla lattico deidrogenasi (EC 1.1.1.27), può essere ossidato a piruvato. Infatti, gli isoenzimi in cui predomina la subunità H, come LDH1 o H4, un omopolimero di subunità H presente nel muscolo cardiaco, un tessuto completamente aerobico, catalizzano preferenzialmente l’ossidazione del lattato.
    L’ossidazione del lattato può avvenire anche negli epatociti, nel corso della gluconeogenesi, favorita dal basso rapporto NADH/NAD+ nel citosol. Si noti comunque che il lattato è un metabolita derivante dal catabolismo del glucosio, e quindi dei carboidrati.
  • Altra fonte importante è rappresentata dal malato, nella reazione catalizzata dall’enzima malico citosolico (EC 1.1.1.40), enzima che svolge un ruolo importante nel trasporto di intermedi del ciclo dell’acido citrico, quali ossalacetato, malato e citrato, tra il citosol e la matrice mitocondriale.

Malato + NADP+ → Piruvato + CO2 + NADPH + H+

  • Infine, anche gli scheletri carboniosi di sei aminoacidi, ossia alanina, cisteina, glicina, serina, treonina e triptofano, possono essere convertiti in toto o in parte in piruvato.

A sua volta il piruvato è un intermedio metabolico che può essere utilizzato in numerose vie metaboliche, sia anaboliche che cataboliche, quali la gluconeogenesi, la sintesi dei lipidi, e il metabolismo ossidativo. Inoltre, può avere anche una funzione anaplerotica, avendo un ruolo nel mantenimento del flusso di metaboliti attraverso il ciclo dell’acido citrico.

Trasporto del piruvato nella matrice mitocondriale

Negli eucarioti, la glicolisi avviene nel citosol mentre tutti i passaggi successivi del metabolismo aerobico, quindi le reazioni catalizzate dal complesso della piruvato deidrogenasi, il ciclo dell’acido citrico, la catena di trasporto degli elettroni e la fosforilazione ossidativa, si svolgono nel mitocondrio.
Similmente a quanto accade per la maggior parte degli altri anioni e metaboliti, il passaggio del piruvato attraverso la membrana mitocondriale esterna è probabilmente mediato da un canale anionico voltaggio-dipendente relativamente non specifico. Il passaggio attraverso la membrana mitocondriale interna è invece assicurato da uno specifico trasportatore formato da due proteine denominate MPC1 e MPC2, acronimo dell’inglese mitochondrial pyruvate carrier, che vanno a formare un complesso etero-oligomerico nella membrana.

Struttura del complesso della piruvato deidrogenasi

Sebbene il complesso della piruvato deidrogenasi sia formato da copie multiple di tre enzimi differenti e catalizzi le medesime reazioni tramite meccanismi simili in tutti gli organismi in cui è presente, ha una struttura quaternaria molto varia.
Il primo complesso di cui fu analizzata la struttura fu quello di E. coli, grazie al lavoro di Lester Reed. Nel complesso multienzimatico, che ha un peso di circa 4600 kD ed un diametro di circa 300 Å, 24 unità di diidrolipoil transacetilasi vanno a formare una struttura con simmetria cubica, ossia, gli enzimi, associati in trimeri, sono disposti agli angoli del cubo. Dimeri di piruvato deidrogenasi si associano al nucleo di diidrolipoil transacetilasi, al centro di ognuno dei 12 bordi del cubo, per un totale 24 unità. Infine, dimeri di diidrolipoil deidrogenasi si vanno a disporre al centro di ognuna delle sei facce del cubo, per un totale di 12 unità. Si noti che l’intero complesso è costituito da 60 unità. Anche nella maggior parte degli altri batteri Gram-negativi si osserva una analoga struttura con simmetria cubica.
In alcuni batteri Gram-positivi e negli eucarioti il complesso della piruvato deidrogenasi presenta una struttura dodecaedrica, ossia quella di un poliedro regolare con 20 vertici, 12 facce pentagonali e 30 bordi, con simmetrica icosaedrica, anche detta simmetria I. Se si considera ad esempio il complesso presente nei mitocondri, questi è il più grande complesso multienzimatico conosciuto, con un peso di circa 1000 kD ed un diametro di circa 500 Å, dunque ben 5 volte le dimensioni di un intero ribosoma, e abbastanza grande da poter essere visualizzabile con il microscopio elettronico. Il complesso è costituito da un nucleo dodecaedrico avente un diametro di circa 25 nm e formato, come nei batteri Gram-negativi, dalla diidrolipoil transacetilasi, ma composto da 20 trimeri dell’enzima, per un totale di 60 unità, disposti ai vertici della struttura. Il nucleo è circondato da 30 unità di piruvato deidrogenasi, una centrata su ogni bordo, e 12 unità di diidrolipoil deidrogenasi, una centrata su ogni faccia. L’intero complesso è quindi costituito da 102 unità.

La struttura quaternaria del complesso è ulteriormente complicata, come menzionato in precedenza, dalla presenza di tre subunità addizionali: la piruvato deidrogenasi chinasi, la piruvato deidrogenasi fosfatasi, e la E3BP.
La chinasi e la fosfatasi sono legate al nucleo di diidrolipoil transacetilasi.
E3BP è legata ad ognuna della 12 facce pentagonali, e dunque presente in circa dodici copie. La proteina è necessaria il legame della diidrolipoil deidrogenasi al nucleo formato dalla diidrolipoil transacetilasi, come dimostrato dal fatto che la sua proteolisi parziale riduce la capacità di legame della deidrogenasi. Nella E3-bindign protein è possibile individuare un dominio C-terminale, privo di attività catalitica, ed un dominio che contiene una lipoil-lisina, simile a quella della diidrolipoil transacetilasi, in grado anche di accettare un gruppo acetilico. Tuttavia, la rimozione di questo dominio non comporta alcuna riduzione dell’attività catalitica del complesso multienzimatico.

Struttura della piruvato deidrogenasi o E1

La piruvato deidrogenasi degli eucarioti e di alcuni batteri Gram-positivi è composta da due differenti catene polipeptide, indicate come α e β, disposte a formare un eterotetramero α2β2 simmetrico. Di contro in E. coli e in altri batteri Gram-negativi le subunità sono fuse a formare un’unica catena polipeptidica e l’enzima risulta un omodimero.
L’enzima presenta due siti attivi.
Considerando la struttura eterotetramerica della piruvato deidrogenasi di Bacillus stearothermophilus, un batterio Gram-positivo, ogni tiamina pirofosfato si lega tra i domini N-terminali di una subunità α e di una β, al termine di un canale a forma di imbuto profondo circa 21 Å che porta al sito attivo, con l’anello tiazolico (vedi fig. 3), il suo gruppo reattivo, posizionato vicino all’ingresso del canale stesso. All’ingresso del canale sono inoltre presenti due anse peptidiche conservate, essenziali sia per l’attività catalitica dell’enzima che per la sua regolazione. L’analisi ai raggi X dell’enzima di B. stearothermophilus, quando lega sia la tiamina pirofosfato che PSBD della diidrolipoil transacetilasi, che si lega al dominio C-terminale delle subunità β, ha evidenziato, oltre ad un eterotetramero con un struttura estremamente compatta, che i due siti attivi hanno una struttura differente, in particolare riguardo alla disposizione delle due anse peptidiche conservate. Infatti, in una subunità dell’enzima, in presenza della forma attivata della tiamina pirofosfato, l’ansa più interna è disposta in modo da bloccare l’ingresso al sito attivo, mentre l’ansa all’ingresso dell’altro sito attivo ha una conformazione tale da non bloccarne l’ingresso. Questo spiega dal punto di vista strutturale le differenze osservate nella velocità di legame del substrato esibite dai due siti attivi. Una disposizione ed una asimmetria simili sono state osservate anche in tutti gli altri enzimi tiamina pirofosfato dipendenti di cui sia nota la struttura.
Oltre alla tiamina pirofosfato e ad uno ione magnesio (Mg2+), localizzati in ciascuno dei due siti attivi dell’enzima, un terzo Mg2+ è posizionato al centro del tetramero, all’interno di un tunnel lungo circa 20 Å, riempito di solvente, che collega i due siti attivi. Il tunnel è in gran parte delimitato da 10 residui amminoacidici conservati, rispettivamente sei residui di glutammato (Glu) e quattro di aspartato (Asp), che provengono da tutte e quattro le subunità, più altri residui acidi attorno all’anello amminopirimidinico della TPP. Va invece sottolineata l’assenza di residui basici che neutralizzino i precedenti. Tunnel simili sono stati osservati in tutti gli enzimi tiamina pirofosfato dipendenti con struttura dimerica o tetramerica di cui sia nota la struttura cristallina, ad esempio nella transchetolasi, enzima della via del pentoso fosfato.

Nota: Bacillus stearothermophilus è un membro del phylum Firmicutes ed è stato da poco rinominato Geobacillus stearothermophilus.

Qual’è la funzione del tunnel acido?

Attraverso esperimenti di mutagenesi condotti sulla piruvato deidrogenasi di B. stearothermophilus è stato dimostrato che il tunnel ha un ruolo nel meccanismo catalitico.
La sostituzione di alcuni dei suddetti residui acidi con amminoacidi neutri non alterava, rispetto alla forma wild-type:

  • l’efficienza dell’incorporazione dell’enzima modificato nel complesso multienzimatico;
  • la struttura dei siti attivi;
  • la struttura quaternaria dell’enzima.

Tuttavia, la velocità di decarbossilazione risultava ridotta di oltre il 70% rispetto all’enzima wild-type, come pure, una volta che l’enzima mutante era inserito nel complesso della piruvato deidrogenasi, l’attività del complesso stesso di oltre l’85%, sempre in confronto alla forma wild-type. Ma a che cosa sono dovute queste riduzioni dell’efficienza catalitica?
Poiché la distanza tra gli amminoacidi sostituiti ed i siti attivi dell’enzima è di 7 o più Å, questi amminoacidi sono troppo lontani dai siti attivi per poterne influenzare direttamente l’attività catalitica. E’ stato quindi proposto il meccanismo di seguito descritto.
Considerando l’apoenzima, la tiamina pirofosfato si lega velocemente e fortemente al primo sito attivo, viene attivata, ed il sito attivo viene chiuso, proteggendo così lo zwitterione tiazolico dall’ambiente esterno.
Nel secondo sito attivo invece la tiamina pirofosfato si lega, ma non viene attivata, e quindi il sito attivo rimane in conformazione aperta.
Nel primo sito attivo il piruvato reagisce con il C-2 tiazolico e la tiamina pirofosfato del secondo sito attivo, che è un acido generale, dona un protone al primo sito. Il risultato è una reazione di decarbossilazione nel primo sito attivo e l’attivazione del coenzima nel secondo sito, che quindi viene chiuso.
Si noti che mentre l’attivazione della prima tiamina pirofosfato è conseguente al legame al sito attivo, l’attivazione della seconda, e quindi del secondo sito attivo, è accoppiata alla decarbossilazione del piruvato nel primo sito attivo. O, da un altro punto di vista, mentre un sito attivo richiede un acido generale, l’altro richiede una base generale.
I protoni sono necessari per l’attività catalitica, ed il loro trasferimento tra i siti attivi avviene attraverso il tunnel acido. Si verifica cioè il loro trasporto reversibile lungo una catena di gruppi accettori-donatori forniti dai residui di glutammato ed aspartato e dalle molecole d’acqua presenti nel tunnel, che nell’insieme agiscono come un vero e proprio filo protonico, in inglese proton wire.
Sembra quindi che, a differenza di quanto accade in molti altri enzimi, in cui la comunicazione tra i siti attivi avviene attraverso modificazioni conformazionali e riarrangiamenti delle subunità che costituiscono l’enzima stesso, nella piruvato deidrogenasi e negli altri enzimi tiamina pirofosfato dipendenti il “proton wire” sia la base molecolare di tale comunicazione.
A questo punto l’oloenzima è formato ed i siti attivi si trovano in un equilibrio dinamico, passando vicendevolmente dallo stato dormiente a quello attivato. Questo sembra essere lo stato in cui si trova l’enzima in vivo all’inizio di ogni ciclo catalitico.
Una conseguenza di un tale meccanismo è che, a mano a mano che i cicli catalitici si susseguono, i due siti attivi sono fuori fase tra di loro, ossia mentre uno richiede una base generale, l’altro necessita di un acido generale, e vice versa.
Da notare infine che un tale meccanismo permette anche il cambio di conformazione delle anse che chiudono i siti attivi, in modo da:

  • coordinare l’uptake dei substrati ed il rilascio dei prodotti:
  • spiegare l’asimmetria esistente tra i due siti attivi.

Nota: un apoenzima è un enzima privo dei suoi cofattori, mentre un oloenzima è un enzima che lega tutti i suoi cofattori. L’apoenzima è la forma cataliticamente inattiva dell’enzima, mentre l’oloenzima ne è la forma cataliticamente attiva.

Struttura della diidrolipoil transacetilasi o E2

Nella struttura della diidrolipoil transacetilasi è possibile individuare tre domini funzionalmente distinti: un dominio lipoilico N-terminale, un dominio centrale di legame o PSBD, acronimo dell’inglese peripheral subunit-binding domain, ed un dominio catalitico C-terminale o acetiltransferasico. Questi domini sono connessi da sequenze di circa 20-40 residui amminoacidici ricche in alanina e prolina, aminoacidi idrofobici che sono inframezzati da residui dotati di carica. Queste sequenze di collegamento sono altamente flessibili ed estese, il che permette di tenere lontani gli uni dagli altri i tre domini.

Complesso della Piruvato Deidrogenasi
Fig. 11 – Domini di E2

Nota: analoghe sequenze di collegamento flessibili sono presenti anche in E3BP.

  • Il dominio lipoilico N-terminale, composto da circa 80 residui amminoacidici, è così chiamato in quanto lega l’acido lipoico. Il numero di questi domini dipende dalla specie considerata, variando da uno a tre. Ad esempio è presente con una copia in B. stearothermophilus e nei lieviti, con due nello Streptococcus faecalis e nei mammiferi, e con tre in Azotobacter vinelandii ed E. coli.
    Il legame tra l’ɛ-amino gruppo della catena laterale di una lisina e l’acido lipoico porta alla formazione di un braccio flessibile, la lipoil-lisina o lipoammide, che alla sua massima estensione ha una lunghezza di circa 14 Å. Se a questo si aggiunge la sequenza che collega il dominio N-terminale al dominio adiacente, la cui lunghezza è superiore ai 140 Å, si ottiene un braccio flessibile in grado di far oscillare il gruppo lipoilico tra i siti attivi della piruvato deidrogenasi e della diidrolipoil deidrogenasi, nonché di interagire con le unità di diidrolipoil transacetilasi vicine.
    Si noti che il numero di queste braccia flessibili in E. coli è pari a 3 x 24 = 72, mentre nei mammiferi a 2 x 60 = 120, sulla base del numero dei domini N-terminali e delle unità di diidrolipoil transacetilasi.
    Da tutto ciò consegue che una piruvato deidrogenasi può acetilare numerose diidrolipoil transacetilasi, e una diidrolipoil deidrogenasi può riossidare diversi gruppi diidrolipoamidici.
    Inoltre, si verifica anche:

un interscambio di gruppi acetilici tra i gruppi lipoilici del nucleo di diidrolipoil transacetilasi;
lo scambio sia di gruppi acetilici che di disolfuri tra le braccia flessibili sopracitate.

  • PSBD è composto da circa 35 residui amminoacidici disposti a formare una struttura globulare che si lega sia alla piruvato deidrogenasi che alla diidrolipoil deidrogenasi, ossia tiene insieme il complesso multienzimatico.
  • Il dominio catalitico C-terminale, che, ovviamente, contiene il sito attivo, è composto da circa 250 residui amminoacidici disposti a formare una struttura simile ad una gabbia vuota che contiene canali sufficientemente larghi da permettere ai substrati e prodotti di diffondere fuori e dentro. Ad esempio, la lipoamide ed il coenzima A, i due substrati della diidrolipoil transacetilasi, si legano in conformazione estesa alle estremità opposte di un canale che si trova localizzato all’interfaccia tra ogni paio di subunità di ciascun trimero.

Struttura della diidrolipoil deidrogenasi o E3

La struttura della diidrolipoil deidrogenasi è stata desunta dalla studio dell’enzima in numerosi microrganismi. Presenta una struttura omodimerica, con ciascuna catena polipeptidica, formata da circa 470 residui amminoacidici, ripiegata a dare quattro domini, dall’estremità N-terminale a quella C-terminale: un dominio legante il FAD, uno legante il NAD, un dominio centrale, ed un dominio di interfaccia. Tutti prendono parte alla formazione del sito attivo.
Il FAD si trova quasi completamente all’interno della proteina in quanto, a differenza del NADH o dei tioli, è facilmente ossidabile e quindi deve essere protetto dalla soluzione circostante, ossia dall’ossidazione ad opera di O2. E infatti, in assenza del NAD+, la catena laterale fenolica di uno specifico residuo di tirosina (Tyr), ad esempio nel batterio Gram-negativo Pseudomonas putida la Tyr181, va a coprire la tasca dove si va a legare la nicotinamide proteggendo il FADH2 dal contatto con la soluzione.

Complesso della Piruvato Deidrogenasi
Fig. 12 -FADH2

Quando invece il NAD+ è in posizione nel sito attivo, la catena laterale fenolica della suddetta tirosina si va a disporre tra l’anello nicotinamidico e quello flavinico.
Nel sito attivo della forma ossidata dell’enzima è presente anche un ponte disolfuro redox-attivo che si forma tra due residui di cisteina presenti in un segmento della catena polipeptidica altamente conservato, ad esempio in P. putida tra la Cys43 e la Cys48. Il disolfuro è localizzato dal lato dell’anello flavinico opposto rispetto a quello che guarda l’anello nicotinammidico, e lega due giri consecutivi di un segmento di un’α-elica distorta. Da notare che in assenza della distorsione dell’ α-elica i Cα delle due cisteine sarebbero troppo distanti per poter permettere la formazione del ponte disolfuro.
La diidrolipoil deidrogenasi possiede quindi due accettori di elettroni: il FAD e il ponte disolfuro redox-attivo.
Nota: i due anelli eterociclici del NAD e del FAD sono paralleli ed in contatto attraverso interazioni di van der Waals; anche S48 è in contatto di van der Waals con l’anello flavinico, dal lato opposto rispetto all’anello nicotinamidico.

Reazione della piruvato deidrogenasi o E1

La piruvato deidrogenasi, nella sequenza delle cinque reazioni catalizzate dai componenti del complesso della piruvato deidrogenasi, ne catalizza le prime due, ovvero:

  • la decarbossilazione del piruvato a dare CO2 e l’intermedio idrossietil-TPP;
  • l’acetilazione riduttiva del gruppo lipoilico della diidrolipoil transacetilasi.

La prima reazione è essenzialmente identica alla reazione catalizzata dalla piruvato decarbossilasi (EC 4.1.1.1), che opera una decarbossilazione non ossidativa nel corso della fermentazione del glucosio ad etanolo. Quello che differisce è il destino del gruppo idrossietilico legato alla tiamina pirofosfato che, nella reazione catalizzata dalla piruvato deidrogenasi viene trasferito all’enzima successivo della sequenza, la diidrolipoil transacetilasi, mentre nella reazione catalizzata dalla piruvato decarbossilasi è convertito in acetaldeide.

Meccanismo di reazione della piruvato deidrogenasi o E1

Nelle reazioni catalizzate da enzimi TPP-dipendenti, l’anello tiazolico rappresenta la parte attiva, ma solo in forma di carbanione dipolare o ilide, ossia uno ione dipolare o zwitterione, con carica positiva sull’N-3 e carica negativa sul C-2. Di contro, l’anello tiazolico con carica positiva, ossia una carica positiva sull’azoto e nessuna carica sul C-2, può essere definito come la forma “dormiente” o inattiva.
La reazione ha inizio con l’attacco nucleofilo da parte del carbanione sul C-2 al carbonio carbonilico del piruvato, che ha lo stato di ossidazione di un’aldeide. L’attacco porta alla formazione di un legame covalente tra il coenzima e il piruvato.
Segue la scissione del legame tra il C-1 ed il C-2 del piruvato. Questo porta al distacco del gruppo carbossilico, ossia del C-1, in forma di CO2, mentre i due restanti atomi di carbonio, il C-2 ed il C-3, rimangono legati alla tiamina pirofosfato in forma di gruppo idrossietilico. La scissione del legame C-1–C-2, e quindi la decarbossilazione del piruvato, è favorita dal fatto che la carica negativa sul C-2, che è instabile, viene stabilizzata grazie alla presenza nell’anello tiazolico dell’azoto imminico carico positivamente, N-3, (C=N+), ossia grazie alla presenza di una struttura elettrofila o elettron deficiente che funge da “pozzo” o “trappola” per gli elettroni, nella quale gli elettroni del carbanione possono delocalizzarsi per risonanza.
A questo punto l’intermedio stabilizzato per risonanza può essere protonato a dare idrossietil-TPP.
Nota: questo primo passaggio della reazione catalizzata dalla piruvato deidrogenasi è quello dove il complesso della privato deidrogenasi esercita la sua specificità di substrato ed è anche il più lento dell’intera sequenza, ossia è quello che limita la velocità della reazione complessiva.

Complesso della Piruvato Deidrogenasi
Fig. 13 – E1: Meccanismo di Reazione

Di seguito, l’enzima catalizza l’ossidazione del gruppo idrossietilico a gruppo acetilico ed il suo trasferimento sul braccio lipoamidico della diidrolipoil transacetilasi. La reazione ha inizio con la formazione di un carbanione sul carbonio idrossilico della idrossietil-TPP, a seguito della rimozione del protone legato al carbonio stesso da parte di una base dell’enzima. Segue l’attacco nucleofilo del carbanione al disolfuro della lipoamide, con formazione di un legame acetil-tioestere ad alta energia con uno dei due tioli. In questa reazione l’ ossidazione del gruppo idrossietilico a gruppo acetilico è accompagnata dalla concomitante riduzione del ponte disolfuro della lipoamide: i due elettroni rimossi dal gruppo idrossietilico sono utilizzati per ridurre il ponte disolfuro. Questa reazione è quindi una acetilazione riduttiva, cui si accoppia la rigenerazione della forma attiva della piruvato deidrogenasi, ossia l’enzima con il C-2 dell’anello tiazolico nella forma deprotonata, la forma ilide o carbanione dipolare.
Si noti che l’energia derivante dall’ossidazione del gruppo idrossietilico a gruppo acetilico permette la formazione del legame tioestere tra il gruppo acetilico ed il coenzima A.

Nota: come detto in precedenza, il braccio di lipoil-lisina, presente in conformazione estesa nel canale dove si trova anche la TPP, permette il trasferimento dell’idrossietile dalla idrossietil-TPP al coenzima A, ossia braccio di lipoil-lisina si può spostare dal sito attivo della piruvato deidrogenasi a quelli della diidrolipoil transacetilasi e quindi della diidrolipoil deidrogenasi;.

Proprietà della tiamina pirofosfato

Nella molecola della tiamina pirofosfato è possibile individuare tre parti distinte, da cui dipendono le sue proprietà chimiche ed enzimologiche: l’anello tiazolico, l’anello 4’-amminopirimidinico, e il gruppo difosfato (vedi fig. 3).
Il difosfato lega il cofattore all’enzima attraverso la formazione di legami elettrostatici tra le cariche negative portate dai suoi gruppi fosforici e quelle positive degli ioni Ca2+ ed Mg2+ che, a loro volta, sono legati a sequenze altamente conservate, rispettivamente: GlyAspGly (GDG) e GlyAspGly-X26-AsnAsn (GDG-X26-NN).
L’anello tiazolico ha un ruolo centrale nella catalisi grazie alla capacità di formare un carbanione, ossia un centro nucleofilo sul C-2.
Nota: come accennato in precedenza, una volta legatasi all’enzima, la tiamina pirofosfato si dispone nel sito attivo in modo che l’anello tiazolico sia posizionato vicino all’ingresso del canale che porta al sito attivo stesso.
L’anello amminopirimidinico ha una duplice funzione:

  • ancora il coenzima tenendolo in posizione;
  • ha uno specifico ruolo catalitico, partecipando ad una catalisi acido/base, come evidenziato da studi condotti utilizzando analoghi della tiamina pirofosfato in cui, a turno, erano stati sostituiti i tre atomi di azoto dell’anello. Questi studi hanno dimostrato che l’atomo N-1’ ed il gruppo amminico legato ad N-4’ sono necessari per l’attività del coenzima, mentre l’atomo N-3’ lo è meno.

Come si forma il carbanione dipolare della tiamina pirofosfato?

E’ possibile individuare tre forme tautomeriche in cui si presenta l’anello amminopirimidinico della tiamina pirofosfato legata allo specifico enzima ancora non impegnato nella reazione:

  • la forma canonica, ossia la 4’-amminopirimidina;
  • la forma protonata su N-1’, ossia lo ione 4’-amminopirimidinio;
  • l’1’,4’-imminopirimidina.

E sembra che la 1’,4’-imminopirimidina sia il tautomero che, prima dell’arrivo del substrato nel sito attivo, subisce la deprotonazione. Il C-2 dell’anello tiazolico è, come spiegato anche nell’articolo sulla via del pentoso fosfato, assai più acido rispetto alla maggior parte degli altri gruppi =C-H presenti in altre molecole. La maggior acidità, ossia il fatto che il protone legato al C-2 sia facilmente dissociabile, è dovuta alla presenza dell’atomo di azoto quaternario con carica positiva dell’anello tiazolico che è in grado di stabilizzare elettrostaticamente il carbanione risultante. Nel processo di deprotonazione sembra avere un ruolo essenziale il gruppo amminico dell’anello amminopirimidinico: il gruppo funge da base ed è posizionato opportunamente per accettare il protone. Tuttavia, nella forma canonica, la 4’-amminopirimidina, uno dei suoi protoni collide stericamente con il protone legato al C-2; in aggiunta anche il suo pK è troppo basso per operare la deprotonazione in modo efficiente. E’ stato quindi proposto un meccanismo in cui la catena laterale di un residuo conservato di glutammato, ad esempio βGlu59 in B. stearothermophilus, o Glu51 nella piruvato decarbossilasi di Saccharomyces uvarum (lievito di birra), donando un protone all’amminopirimidina la converte nella sua forma immino tautomerica, la 1’,4’-imminopirimidina, che, accettando il protone dal C-2, torna alla forma canonica 4’-amminopirimidinica e permette la formazione del carbanione.

Nota: la formazione del carbanione sul C-2 è quindi conseguenza di un trasferimento protonico intramolecolare.

Deprotonazione della tiamina pirofosfato e chiusura del sito attivo

La perdita del protone dal C-2 dell’anello tiazolico porta, da una situazione con carica positiva sull’anello, alla formazione di uno ione dipolare o zwitterione. Questo cambio nello stato di carica innesca una modificazione conformazionale in una delle due anse peptidiche conservate presenti all’ingresso del canale che immette al sito attivo, nello specifico la più interna, modificazione che, a sua volta, porta alla chiusura dello canale rispetto all’ambiente acquoso circostante. In questa conformazione chiusa il carbanione tiazolico è protetto dall’attacco di reagenti vari, come elettrofili.
Riassumendo, la deprotonazione della tiamina pirofosfato determina la chiusura del sito attivo e la protezione del carbanione dipolare neoformato; in altri termini, gli enzimi TPP-dipendenti sarebbero attivi solo nella conformazione chiusa.
Se invece si considera l’altro sito attivo, la sua tiamina pirofosfato non è in forma di ilide, il è canale aperto, ed il sito stesso risulta inattivo.

Reazione della diidrolipoil transacetilasi o E2

La diidrolipoil transacetilasi catalizza la terza reazione della sequenza delle cinque catalizzate dai componenti del complesso della piruvato deidrogenasi, ossia il trasferimento del gruppo acetilico dall’acetil-diidrolipoammide al coenzima A, a dare acetil-CoA e la forma completamente ridotta della lipoammide, la diidrolipoammide, il ditiolo.
Va notato che il gruppo acetilico, inizialmente legato tramite legame estere ad uno dei gruppi –SH della lipoammide è di seguito legato al gruppo –SH del coenzima A, di nuovo attraverso legame estere, da cui il termine di transesterificazione.

Meccanismo di reazione della diidrolipoil transacetilasi o E2

Nel corso della reazione, il gruppo sulfidrilico del coenzima A porta un attacco nucleofilo al carbonio carbonilico del gruppo acetilico dell’acetil diidrolipoammide-diidrolipoil transacetilasi a formare un intermedio tetraedrico transiente che si “decompone” a dare acetil-CoA e diidrolipoammide-diidrolipoil transacetilasi.

Complesso della Piruvato Deidrogenasi
Fig. 14 – E2: Meccanismo di Reazione

Come già detto, nel meccanismo di reazione gioca un ruolo centrale la mobilità della lipoammide.

Reazione della diidrolipoil deidrogenasi o E3

La diidrolipoil deidrogenasi catalizza la quarta e la quinta reazione della sequenza delle cinque catalizzate dai componenti del complesso della piruvato deidrogenasi.
L’enzima catalizza trasferimenti di elettroni necessari per rigenerare il ponte disolfuro della lipoammide della diidrolipoil transacetilasi, ossia per rigenerare la forma ossidata del gruppo prostetico e completare così il ciclo catalitico della transacetilasi.
La reazione segue un meccanismo a ping-pong, procedendo attraverso due semireazioni consecutive nelle quali i due substrati, la diidrolipoammide ed il NAD+, reagiscono uno in assenza dell’altro. Inoltre durante la prima semireazione, il rilascio del primo prodotto e la formazione di un complesso enzima-intermedio si verificano prima che il secondo substrato si leghi, mentre l’enzima va incontro ad un cambio strutturale, mentre nella seconda semireazione si verificano il rilascio del secondo prodotto ed il ritorno dell’enzima allo stato iniziale, di nuovo attraverso una modificazione strutturale.
Considerando la cinetica del meccanismo a ping-pong della diidrolipoil deidrogenasi:

  • nella prima semireazione si verifica l’ossidazione della diidrolipoamide a lipoammide;
  • nella seconda semireazione si verifica la riduzione del NAD+ a NADH.

Meccanismo di reazione della diidrolipoil deidrogenasi o E3

Di seguito viene descritto il meccanismo di reazione della diidrolipoil deidrogenasi di P. putida.
Nella prima semireazione l’enzima in forma ossidata (E), ossia con il ponte disolfuro tra la Cys43 e la Cys48, lega la diidrolipoammide (LH2) a formare il complesso enzima-diidrolipoammide (E●LH2). A questo punto un atomo di zolfo della diidrolipoammide porta un attacco nucleofilo allo zolfo della Cys43, con formazione di un ponte disolfuro lipoammide-Cys43, (E–S–S–L), mentre lo zolfo della Cys48 viene rilasciato in forma di ione tiolato (S48).
Il protone che è rimasto sul secondo gruppo tiolico della lipoammide è quindi estratto ad opera dell’istidina (Hys) 451, che agisce come catalizzatore acido-base generale, il che porta alla formazione di un secondo ione tiolato, stavolta sulla lipoamide (E–S–S–L●S), il quale, attraverso un attacco nucleofilo, va a sostituire lo zolfo della Cys43, S43, aiutato in questo attacco dalla catalisi acida generale ad opera della Hys451 che dona un protone ad S43. L’azione catalitica della Hys451 è essenziale, come dimostrato da studi di mutagenesi in cui la sua sostituzione con un residuo di glutammina fa si che l’enzima mantenga solamente circa lo 0,4% dell’attività catalitica rispetto alla forma wild-type.
L’anione tiolato S48 entra quindi in contatto, mediante interazioni non covalenti, con l’anello flavinico in vicinanza della sua posizione 4a (vedi fig. 4), ossia una coppia di elettroni di S48, che funge da donatore di elettroni, è parzialmente trasferita all’anello flavinico ossidato, che a sua volta funge da accettore di elettroni. La struttura derivante è chiamata complesso a trasferimento di carica.
Nel frattempo la catena laterale fenolica della Tyr181 continua a bloccare l’accesso all’anello flavinico, proteggendolo così dall’ossidazione da parte di O2.

Complesso della Piruvato Deidrogenasi
Fig. 15 – Ossidazione della Diidrolipoammide da parte di E3

Riassumendo, quello che si verifica è una reazione di interscambio di ponti disolfuro che porta alla formazione della forma ossidata della lipoammide, il primo prodotto, che è rilasciata, e della forma ridotta della diidrolipoil deidrogenasi.

La seconda semireazione comporta la riduzione del NAD+ a NADH + H+ mediante il trasferimento di elettroni dal disolfuro reattivo dell’enzima via FAD.

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Fig. 16 – Ossidazione di E3 Ridotta mediante NAD+

Il tutto ha inizio con l’ingresso nel sito attivo del NAD+ ed il suo legame a formare il complesso EH2●NAD+. Si noti che l’ingresso del coenzima determina lo spostamento a lato della catena laterale fenolica della Tyr181 ad opera dell’anello nicotinammidico.
A seguito del collasso del complesso a trasferimento di carica si forma un legame covalente tra il C-4a dell’anello flavinico ed S48, a cui si accompagna l’estrazione di un protone da parte dell’N-5 flavinico, con formazione del corrispondente anione tiolato S43.
S43 porta un attacco nucleofilo ad S48, attacco che determina la formazione del ponte disolfuro redox-attivo tra la Cys43 e la Cys48, cui segue la rottura del legame covalente tra S48 e il C-4a dell’anello flavinico a dare l’anione FADH, con carica negativa su N-1. Si noti che la diidrolipoil deidrogenasi è nuovamente nella forma ossidata (E).

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Fig. 17 – FADH-

Il FADH ha un’esistenza transitoria in quanto si verifica il trasferimento praticamente immediato del protone legato ad N-5, in forma di ione idruro, al C-4 dell’anello nicotinamidico, che è giustapposto all’N-5 flavinico. Questo porta alla formazione di FAD e del secondo prodotto della reazione, il NADH, che lascia l’enzima.
In definitiva gli elettroni che sono stati rimossi dal gruppo idrossietilico derivato dal piruvato passano, via FAD, al NAD+. In questo modo si è completato il ciclo catalitico della diidrolipoil deidrogenasi, essendo l’enzima ed il suo coenzima nella loro forma ossidata. A questo punto anche il ciclo catalitico dell’intero complesso della piruvato deidrogenasi si è completato, ed il complesso stesso è pronto per un altro ciclo di reazioni.

Nota: a differenza dell’anello tiazolico della tiamina pirofosfato, il FAD non ha la funzione di “trappola” o “pozzo” per gli elettroni quanto piuttosto di condotta per gli elettroni tra il disolfuro redox-attivo, nella sua forma ridotta, ed il NAD+.

Nota: il meccanismo catalitico della diidrolipoil deidrogenasi è stato in gran parte determinato in analogia con quello della glutatione reduttasi (EC 1.8.1.7), al 33% identica ma strutturalmente molto meglio caratterizzata. Va tuttavia notato che, sebbene i due enzimi catalizzino reazioni simili, queste normalmente corrono in direzione opposta:

  • la diidrolipoil deidrogenasi utilizza il NAD+ per ossidare due gruppi –SH a dare un disolfuro (–S–S–);
  • la glutatione reduttasi utilizza il NADPH per ridurre un –S–S– a due gruppi tiolici.

Nonostante ciò, i siti attivi dei due enzimi sono strettamente sovrapponibili.

Regolazione dell’attività del complesso della piruvato deidrogenasi

Nei mammiferi, la regolazione dell’attività del complesso della piruvato deidrogenasi è essenziale, sia nello stato di digiuno che in quello alimentato. Infatti, il complesso multienzimatico svolge un ruolo centrale nel metabolismo in quanto, catalizzando la decarbossilazione ossidativa irreversibile del piruvato, rappresenta la porta di ingresso dello scheletro carbonioso dei carboidrati e di circa il 50% dello scheletro carbonioso degli amminoacidi glucogenici, che nell’insieme costituiscono circa il 60% dell’apporto calorico giornaliero, verso:

  • il ciclo dell’acido citrico, e quindi alla completa ossidazione a CO2;
  • la sintesi degli lipidi (nello stato alimentato) e dell’acetiolcolina (vedi sopra).

L’importanza della regolazione della conversione del piruvato in acetil-CoA è sottolineata anche dal fatto che i mammiferi, sebbene siano in grado di produrre glucosio dal piruvato, non sono in grado di farlo dall’acetil-CoA, sia a causa della irreversibilità della reazione catalizzata dalla piruvato deidrogenasi che dell’assenza di vie metaboliche alternative in grado di farlo. L’inibizione dell’attività del complesso permetterà quindi di risparmiare glucosio e gli aminoacidi che possono essere convertiti in piruvato, come l’alanina, quando sono disponibili altri carburanti, ad esempio l’acetil-CoA derivante dall’ossidazione degli acidi grassi.
Per questi motivi l’attività del complesso è finemente regolata attraverso:

  • inibizione a feed-back, anche nota come inibizione da prodotto finale;
  • nucleotidi;
  • modificazioni covalenti, ossia fosforilazioni e defosforilazioni di specifiche proteine bersaglio.

Regolazione dell’attività del complesso della piruvato deidrogenasi attraverso inibizione da prodotto finale e stato energetico della cellula

L’attività della forma defosforilata del complesso della piruvato deidrogenasi è regolata attraverso inibizione a feed-back o inibizione da prodotto finale.
Acetil-CoA e NADH inibiscono allostericamente gli enzimi che ne catalizzano la sintesi, rispettivamente diidrolipoil transacetilasi e la diidrolipoil deidrogenasi.
Inoltre, il CoA e l’acetil-CoA, così come il NAD+ ed il NADH, competono per i siti di legame sui rispettivi enzimi, i quali catalizzano reazioni reversibili. Questo significa che, in presenza di elevati valori dei rapporti [NADH]/[NAD+] e [Acetil-CoA]/[CoA], le reazioni di transacetilazione e deidrogenazione vanno nella direzione opposta rispetto a quella della formazione dell’acetil-CoA; di conseguenza la diidrolipoil transacetilasi non può accettare il gruppo idrossietilico dalla TPP in quanto è mantenuta nella forma acetilata. Questo fa si che la tiamina pirofosfato rimanga legata alla piruvato deidrogenasi nella sua forma idrossietilica, il che a sua volta riduce la velocità di decarbossilazione del piruvato. Quindi, elevati valori dei rapporti [NADH]/[NAD+] e [Acetil-CoA]/[CoA] influenzano indirettamente l’attività della piruvato deidrogenasi.

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Fig. 18 – PDC: Inibizione a Feed-back

Acetil-CoA e NADH sono prodotti anche durante l’ossidazione degli acidi grassi, via metabolica che, al pari delle reazioni catalizzate dal complesso della piruvato deidrogenasi, si verifica nel mitocondrio. Questo significa che la cellula, attraverso la regolazione dell’attività del complesso multienzimatico, è in grado di preservare le riserve di carboidrati quando sono disponibili acidi grassi per la produzione di energia. Questo per esempio è quanto accadde nel digiuno, quando il fegato, il muscolo scheletrico e molti altri organi e tessuti si affidano principalmente all’ossidazione degli acidi grassi per la produzione di energia. Di contro, l’attività del complesso è aumentata nello stato alimentato, quando molti differenti tipi di cellule e tessuti utilizzano in prevalenza il glucosio come fonte di energia.
Più in generale, quando la produzione di NADH e/o acetil-CoA supera la capacità della cellula di utilizzarli per la produzione di ATP, l’attività del complesso della piruvato deidrogenasi è inibita. Analogo discorso vale nella condizione in cui non ci sia necessità di produrre ulteriore ATP. Infatti l’attività catalitica del complesso multienzimatico è sensibile anche allo stato energetico della cellula. Attraverso meccanismi allosterici, elevati livelli di ATP inibiscono l’attività della componente piruvato deidrogenasi del complesso multienzimatico, mentre elevati livelli di ADP, che segnalano che la cellula potrebbe entrare in una fase di carenza di energia, lo attivano, indirizzando quindi lo scheletro carbonioso dei carboidrati e di alcuni aminoacidi verso la produzione di energia.

Nota: nel muscolo scheletrico l’attività del complesso della piruvato deidrogenasi aumenta con l’aumento dell’attività aerobica, il che si traduce in una maggiore dipendenza del muscolo dal glucosio come fonte di energia.

Regolazione dell’attività del complesso della piruvato deidrogenasi attraverso fosforilazione/defosforilazione

A differenza di quanto accade nei procarioti, nei mammiferi l’attività del complesso della piruvato deidrogenasi è regolata anche attraverso modificazioni covalenti, ossia fosforilazioni e defosforilazioni di tre specifici residui di serina presenti sulla subunità α della piruvato deidrogenasi, l’enzima che catalizza il primo passaggio, irreversibile dell’intera sequenza di reazioni.
Nota: poiché la piruvato deidrogenasi dei mammiferi è un eterotetramero, ci sono sei potenziali siti di fosforilazione.

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Fig. 19 – PDC: Regolazione Mediante Modificazione Covalente

La fosforilazione, che inattiva la piruvato deidrogenasi, e quindi blocca l’intera sequenza di reazioni, è catalizzata dalla piruvato deidrogenasi chinasi. Due delle suddette serine si trovano su una delle due anse presenti all’ingresso del canale per il substrato che porta al rispettivo sito attivo, quella più vicina all’estremità C-terminale, e la fosforilazione di uno solo di questi residui inattiva la piruvato deidrogenasi, dimostrando così la l’accoppiamento fuori fase tra i due siti attivi.
Nello stato defosforilato invece il complesso risulta attivo. La defosforilazione è catalizzata da una specifica protein fosfatasi, la piruvato deidrogenasi fosfatasi.
Le attività della piruvato deidrogenasi chinasi e della piruvato deidrogenasi fosfatasi sono a loro volta soggette a regolazione allosterica da parte di numero effettori.

Regolazione dell’attività della piruvato deidrogenasi chinasi

L’attività della piruvato deidrogenasi chinasi dipende dal valore dei rapporti [NADH]/[NAD+], [acetil-CoA]/[CoA], e [ATP]/[ADP], come anche dalla concentrazione del piruvato, nella matrice mitocondriale (vedi fig. 19).

  • Elevati valori dei rapporti [NADH]/[NAD+] e [acetil-CoA]/[CoA], come nel corso dell’ ossidazione degli acidi grassi e dei corpi chetonici, attivano la chinasi, la piruvato deidrogenasi viene fosforilata, e il complesso multienzimatico risulta inibito. Questo permette ai tessuti, come ad esempio il muscolo cardiaco, di risparmiare glucosio quando si stanno utilizzando acidi grassi e/o corpi chetonici per la produzione di energia, in quanto la sintesi di acetil-CoA dal piruvato, e quindi dai carboidrati (e da alcuni aminoacidi) e bloccata.
    Quando invece le concentrazioni di NAD+ e coenzima A sono elevate l’attività catalitica della chinasi è inibita ed il complesso risulta attivo.
    Quindi, acetil-CoA e NADH, due dei tre prodotti finali delle reazione catalizzate dal complesso della piruvato deidrogenasi, controllano allostericamente la propria sintesi regolando direttamente e indirettamente, tramite la regolazione dell’attività della piruvato deidrogenasi chinasi, l’attività del complesso multienzimatico.
  • Elevati valori del rapporto [ATP]/[ADP] attivano la chinasi, e quindi inibiscono il complesso multienzimatico.
    Nota: a differenza di molte altre chinasi, come quelle che intervengono nel controllo del metabolismo del glicogeno, la piruvato deidrogenasi chinasi non è regolata dai livelli di cAMP, bensì da molecole che segnalano variazioni nel livello della carica energetica della cellula e nella disponibilità di intermedi biosintetici, ossia rispettivamente ATP e NADH e acetil-CoA.
  • Il piruvato è un effettore allosterico negativo della piruvato deidrogenasi chinasi.
    Quando i suoi livelli sono elevati, il suo legame alla chinasi la inattiva, la piruvato deidrogenasi non viene fosforilata, ed il complesso della piruvato deidrogenasi rimane attivo.
  • La piruvato deidrogenasi chinasi è attivata anche a seguito dell’interazione con la diidrolipoil transacetilasi nella sua forma acetilata, ossia quando è presente la acetil-diidrolipoamide.

Altri attivatori della piruvato deidrogenasi chinasi sono gli ioni potassio e magnesio.

Regolazione dell’attività della piruvato deidrogenasi fosfatasi

L’attività della piruvato deidrogenasi fosfatasi dipende dal valore dei rapporti [NADH]/[NAD+] e [acetil-CoA]/[CoA], come anche dalla [Ca2+], nella matrice mitocondriale (vedi fig. 19).

  • Bassi valori dei rapporti [NADH]/[NAD+] e [acetil-CoA]/[CoA] attivano la fosfatasi, la piruvato deidrogenasi viene defosforilata, e il complesso multienzimatico risulta attivo.
    Al contrario, in presenza di elevati valori dei suddetti rapporti l’attività della fosfatasi si riduce, quella della chinasi aumenta, e il complesso multienzimatico viene inibito.
  • Lo ione calcio attiva la piruvato deidrogenasi fosfatasi.
    Ca2+ è un importante secondo messaggero che segnala la necessità da parte della cellula di ulteriore energia. Quindi, quando è presente in elevate concentrazioni, come nelle cellule muscolari cardiache a seguito della stimolazione da parte dell’adrenalina, o nella cellule muscolari scheletriche nel corso della contrazione muscolare, la fosfatasi è attiva, il complesso è defosforilato, e quindi attivato.
  • Anche l’insulina interviene nel controllo dell’attività catalitica del complesso della piruvato deidrogenasi attraverso l’attivazione della piruvato deidrogenasi fosfatasi. L’ormone, in risposta all’aumento della glicemia, stimola sia la sintesi del glicogeno che dell’acetil-CoA, precursore nella sintesi degli lipidi.

Anche il digiuno e la successiva rialimentazione influiscono sull’attività del complesso multienzimatico.
In tessuti come il muscolo scheletrico, il muscolo cardiaco o il rene, il digiuno riduce in modo significativo l’attività del complesso, mentre la rialimentazione inverte la situazione.
Nel cervello invece non si osservano queste variazioni poiché l’attività del complesso della piruvato deidrogenasi è essenziale per la produzione di ATP.

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