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Enzimi multifunzionali

Gli enzimi multifunzionali sono proteine in cui due o più siti attivi che catalizzano reazioni consecutive di una via metabolica sono presenti in una catena polipeptidica. Sembra probabile che derivino da eventi di fusione genica rappresentando, al pari dei complessi multienzimatici, una soluzione adottata dall’evoluzione per massimizzare l’efficienza catalitica, assicurando vantaggi che non si avrebbero nel caso in cui le singole attività enzimatiche fossero presenti su proteine distinte e libere.

INDICE

Quali vantaggi offrono gli enzimi multifunzionali?

Gli organismi viventi combattono con l’inevitabile processo di decadimento che, se non contrastato, conduce ad un crescente aumento del disordine, sino alla morte. A livello molecolare il mantenimento della vita è reso possibile dalla grande efficienza raggiunta dagli enzimi nell’accelerare le reazioni chimiche e nell’evitare reazioni collaterali. Un’idea della velocità con cui procede il metabolismo cellulare è fornita dalla velocità del turn over dell’ATP in una cellula di mammifero: ogni 1-2 minuti l’intero pool del trifosfato è idrolizzato e risintetizzato. Tradotto in numeri questo corrisponde al turn over di circa 107 molecole di ATP al secondo, e, per il corpo umano, a circa 1 grammo di ATP al minuto. Alcuni enzimi hanno addirittura raggiunto la perfezione catalitica, ossia sono talmente efficienti che quasi ogni collisione con il proprio substrato porta alla catalisi.
Enzimi multifunzionaliE uno dei fattori limitanti la velocità di una reazione enzimatica è la proprio frequenza con cui enzimi e substrati collidono. Il modo più semplice per aumentare la frequenza delle collisioni sarebbe quello di aumentare la concentrazione di substrati ed enzimi. Tuttavia, dato l’elevatissimo numero di differenti reazioni che avvengono all’interno della cellula, questa strada non è praticabile. Esiste cioè un limite alle concentrazioni che substrati ed enzimi possono raggiungere, concentrazioni che sono dell’ordine delle micromoli per i substrati, e anche più basse per gli enzimi. Fanno eccezione gli enzimi della glicolisi nelle cellule muscolari e negli eritrociti, presenti in concentrazioni dell’ordine delle 0.1 mM e anche maggiori.
Una delle strade percorse dall’evoluzione per aumentare la velocità con cui procedono le reazioni enzimatiche è stata quella di selezionare strutture molecolari, quali gli enzimi multifunzionali ed i complessi multienzimatici, che permettano, attraverso l’ottimizzazione dell’organizzazione spaziale degli enzimi di una via metabolica, di minimizzare la distanza che il prodotto della reazione A deve percorrere per raggiungere il sito attivo che catalizza la reazione successiva B, e così via, ottenendo cioè l’incanalamento dei substrati della via stessa. Per alcuni enzimi multifunzionali e complessi multienzimatici l’incanalamento è ottenuto grazie alla presenza di veri e propri tunnel intramolecolari. L’incanalamento dei substrati migliora l’efficienza catalitica, e quindi la velocità di reazione, in vari modi, di seguito brevemente descritti.

  • Minimizza la diffusione nel mezzo circostante del reagente, quindi la sua diluizione, permettendo così di raggiungere concentrazioni locali elevate, anche quando la sua concentrazione nella cellula è bassa, aumentando quindi la frequenza delle collisioni enzima-substrato.
  • Riduce il tempo di transito dei substrati da un sito attivo al successivo.
  • Minimizza la probabilità che si verifichino reazioni collaterali.
  • Minimizza la probabilità che intermedi chimicamente labili siano degradati.

Gli enzimi multifunzionali offrono vantaggi anche dal punto di vista della regolazione della loro sintesi, essendo possibile coordinare la sintesi di tutte le attività enzimatiche interessate grazie al fatto che la struttura è codificata da un singolo gene.

Infine, analogamente ai complessi multienzimatici, è possibile regolare in modo coordinato le attività enzimatiche presenti. Se a questo si aggiunge che spesso l’enzima che catalizza la tappa di comando della sequenza è quello che catalizza la prima reazione, è possibile sia evitare la sintesi di molecole non necessarie, che sarebbero invece prodotte se la tappa di comando fosse a valle della prima reazione, come pure uno spreco di energia e la sottrazione di metaboliti ad altre vie metaboliche.

Esempi di enzimi multifunzionali

Al pari dei complessi multienzimatici, anche gli enzimi multifunzionali sono molto comuni e coinvolti in vie metaboliche sia anaboliche che cataboliche.
Di seguito alcuni esempi.

Acetil-CoA carbossilasi

L’acetil-CoA carbossilasi o ACC (EC 6.4.1.2), una carbossilasi biotina-dipendente, è formata da due enzimi, la biotina carbossilasi (EC 6.3.4.14) e una transcarbossilasi, più la proteina trasportatrice della biotina o BCCP, acronimo dell’inglese biotin carboxyl-carrier protein. ACC catalizza la sintesi del malonil-CoA via carbossilazione dell’acetil-CoA. La reazione, che rappresenta la tappa di comando della sintesi degli acidi grassi, procede in due tappe. Nella prima la biotina carbossilasi catalizza il trasferimento di una molecola di anidride carbonica (CO2) dallo ione bicarbonato ad un atomo di azoto dell’anello della biotina, che funge da trasportatore temporaneo di CO2. La reazione comporta il consumo di una molecola di ATP. Nella seconda tappa la transcarbossilasi catalizza il trasferimento del gruppo carbossilico dalla carbossi-biotina all’acetil-CoA a dare malonil-CoA. Il malonil-CoA verrà di seguito utilizzato come donatore di unità bicarboniose dalla acido grasso sintasi (EC 2.3.1.85) durante l’allungamento degli acidi grassi.
Nei mammiferi e negli uccelli l’acetil-CoA carbossilasi è un enzima multifunzionale essendo le due attività enzimatiche, e BCCP, presenti su un’unica catena polipeptidica. Nei batteri invece ACC è un complesso multienzimatico formato dall’aggregazione di tre catene polipeptidiche, ossia i due enzimi più BCCP.
Nelle piante superiori sono presenti entrambe le forme.

Acido grasso sintasi di tipo I

L’acido grasso sintasi o FAS, acronimo dell’inglese fatty acid synthase, catalizza la sintesi dell’acido palmitico utilizzando il malonil-CoA, che è il prodotto della reazione catalizzata dalla acetil-CoA carbossilasi, come donatore di unità bicarboniose.
Esistono due tipi di acido grasso sintasi.
Negli animali e nei funghi è un enzima multifunzionale, ed è detto di tipo I. Negli animali è un omodimero, ed in ogni catena polipeptidica sono presenti le sette le attività enzimatiche e la proteina trasportatrice di acili o ACP, acronimo dell’inglese acyl carrier protein. Nei lieviti e nei funghi FAS è formata da due subunità multifunzionali, dette α and β, disposte a formare una struttura eterododecamerica α6β6.
Nella maggior parte dei procarioti e nelle piante l’acido grasso sintasi, detta di tipo II, non è un enzima multifunzionale ma un complesso multienzimatico essendo composto da enzimi distinti più  ACP.

PRA isomerasi:IGP sintasi

La sintesi dell’aminoacido triptofano a partire dal corismato coinvolge diversi passaggi, di seguito brevemente descritti.
Nel primo, la glutammina dona un atomo di azoto all’anello indolico del corismato, che è convertito in antranilato, e la glutammina in glutammato; la reazione è catalizzata dalla antranilato sintasi (EC 4.1.3.27). L’antranilato è fosforibosilato a spese del 5-fosforibosil-1-pirofosfato o PRPP, acronimo dell’inglese 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate, a dare N-(5’-fosforibosil)-antranilato o PRA, acronimo dell’inglese N-(5′-phosphoribosyl)-anthranilate, nella reazione catalizzata dalla antranilato fosforibosiltransferasi (EC 2.4.2.18). Nel passaggio successivo, catalizzato dalla PRA isomerasi (EC 5.3.1.24), PRA è isomerizzato a dare enol-1-o-carbossifenilamino-1-desossiribulosio fosfato o CdRP, acronimo dell’inglese enol-1-o-carboxyphenylamino-1-desoxyribulose phosphate. CdRP, è convertito in indolo-3-glicerolo fosfato o IGP, acronimo dell’inglese indole-3-glycerol phosphate, nella reazione catalizzata dalla indolo-3-glicerofosfato sintasi o IGP sintasi (EC 4.1.1.48). Infine, la triptofano sintasi (EC 4.2.1.20) catalizza gli ultimi due passaggi della via: la conversione di IGP in indolo, una idrolisi, e la reazione dell’indolo con una serina a dare il triptofano.
In E. coli, PRA isomerasi e IGP sintasi sono presenti su un’unica catena polipeptidica, che è quindi un enzima bifunzionale. In altri microorganismi, come Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium e Pseudomonas putida le due attività enzimatiche sono presenti su catene polipeptidiche distinte.
La triptofano sintasi è invece un esempio di complesso multienzimatico, ed uno degli esempi meglio caratterizzati di canalizzazione del flusso dei metaboliti.

Glutammina-PRPP amido transferasi

La glutammina-PRPP ammidotransferasi (EC 2.4.2.14) catalizza la prima della 10 tappe che portano alla sintesi de novo delle purine, ossia la formazione della 5-fosforibosilammina a seguito del trasferimento dell’azoto ammidico della glutammina, che funge quindi da fonte di azoto, al PRPP.
La reazione procede in due tappe, catalizzate nei due siti attivi dell’enzima, un sito N-terminale ed uno C-terminale. Nella prima tappa, il sito attivo N-terminale catalizza l’idrolisi dell’azoto ammidico della glutammina a dare ammoniaca e glutammato. Nella seconda tappa, catalizzata dal sito attivo C-terminale, che ha attività fosforibosiltransferasica, l’ammoniaca precedentemente rilasciata viene legata al C-1 del PRPP a dare la 5-fosforibosilammina. In questa reazione si verifica l’inversione della configurazione del C-1 del ribosio, da α a β, stabilendo la forma anomerica del nucleotide in via di sintesi.
Ci sono tre punti di controllo che cooperano nella regolazione della sintesi de novo dei nucleotidi purinici, e la reazione catalizzata dalla glutammina-PRPP ammidotransferasi, che è anche la prima reazione esclusiva della via, è il primo.
Al pari del complesso della carbamil fosfato sintetasi batterica, anche i siti attivi di questo enzima multifunzionale sono connessi attraverso un canale intramolecolare. Tuttavia questo canale è più corto, essendo lungo circa 20 Å, ed è delimitato da residui amminoacidici non polari, quindi è altamente idrofobico. Mancando gruppi in grado di stabilire legami idrogeno, il tunnel permette la diffusione dell’ammoniaca verso il secondo sito attivo.

CAD

La sintesi de novo dei nucleotidi pirimidinici avviene attraverso una serie di reazioni enzimatiche che, a differenza di quanto accade nella sintesi de novo dei nucleotidi purinici, comporta dapprima la formazione dell’anello pirimidinico e quindi il suo legame al ribosio-5-fosfato. Le prime tre tappe della via sono catalizzate in sequenza dalla carbamil fosfato sintetasi (EC 6.3.4.16), aspartato transcarbamilasi (EC 2.1.3.2) e diidroorotasi (EC 3.5.2.3), e sono comuni a tutte le specie.
Nella prima tappa, la carbamil fosfato sintetasi, che presenta due attività enzimatiche, ossia una attività amidotransferasica glutammina dipendente ed un’attività sintasica, catalizza la sintesi del carbamil fosfato a partire da glutammina, ione bicarbonato ed ATP. Nella seconda tappa, che è quella di comando della via metabolica ed è catalizzata dalla aspartato transcarbamilasi, il carbamil fosfato reagisce con l’aspartato a dare l’N-carbamil aspartato. Infine la diidroorotasi, catalizzando la rimozione di una molecola d’acqua dall’N-carbamil aspartato, porta alla chiusura dell’anello pirimidinico a formare L-diidroorotato.
Negli eucarioti, in particolare nei mammiferi, in Drosofila e Dictyostelium, un genere di amebe, le tre attività sono presenti su una singola catena polipeptidica, codificata da un singolo gene derivante da una fusione avvenuta almeno 100 milioni di anni fa. L’enzima multifunzionale, abbreviato come CAD, è un omomultimero composto da tre subunità o più.
Nei procarioti invece i tre enzimi sono indipendenti, e la carbamil fosfato sintetasi è un esempio di complesso multienzimatico.
Nei lieviti l’attività diidroorotasica è presente su una proteina separata.
Studi sull’attività enzimatica hanno rivelato l’esistenza di un incanalamento dei substrati, più efficace nella proteina del lievito, riguardo ai primi due passaggi, rispetto a quella dei mammiferi.

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Complessi multienzimatici

I complessi multienzimatici sono strutture discrete e stabili formate da enzimi associati in modo non covalente che catalizzano due o più reazioni consecutive di una via metabolica.
Possono essere considerati come un passo in avanti nell’evoluzione dell’efficienza catalitica in quanto assicurano vantaggi che i singoli enzimi, anche quelli che hanno raggiunto la perfezione catalitica, da soli non avrebbero.

INDICE

Quali vantaggi offrono i complessi multienzimatici?

Nel corso dell’evoluzione alcuni enzimi si sono evoluti sino al raggiungimento della perfezione catalitica. Si tratta cioè di enzimi per i quali quasi ogni collisione con il proprio substrato ne determina la conversione in prodotto. Esempi sono:

  • la fumarasi (EC 4.2.1.2), che catalizza la settima tappa del ciclo dell’acido citrico, ossia l’idratazione/deidratazione reversibile del doppio legame del fumarato a dare malato;
  • l’acetilcolinesterasi (EC 3.1.1.7), che catalizza l’idrolisi dell’acetilcolina, un neurotrasmettitore, in colina e acido acetico, che a sua volta si dissocia a dare acetato e ioni idrogeno;
  • la superossido dismutasi (EC 1.15.1.1), che catalizza la conversione, e quindi l’inattivazione, del radicale superossido (O2.-), una specie molto reattiva, in perossido d’idrogeno od acqua ossigenata (H2O2) ed acqua;
  • la catalasi (EC 1.11.1.6), che catalizza la degradazione di H2O2 in acqua ed ossigeno.

La velocità con cui avviene una reazione enzimatica è dunque in parte è determinata dalla frequenza con cui i substrati e gli enzimi stessi collidono. Ne deriva che un modo semplice per aumentarla sia quello di aumentare le concentrazioni di enzima e substrato. Tuttavia, visto l’enorme numero di reazioni che si verificano all’interno della cellula le loro concentrazioni non potranno essere elevate. Ed infatti nella cellule la concentrazione della maggior parte dei metaboliti è dell’ordine delle micromoli (10-6 M), e per la maggior parte degli enzimi anche più bassa.
L’evoluzione ha quindi imboccato strade differenti per aumentare la velocità di reazione, una delle quali è stata quella di ottimizzare l’organizzazione spaziale degli enzimi con la formazione dei complessi multienzimatici e degli enzimi multifunzionali, ossia strutture che permettono di minimizzare la distanza che il prodotto di una reazione deve percorrere per passare al sito attivo che catalizza la reazione successiva, essendo i siti attivi vicini gli uni agli altri. Si verifica cioè l’incanalamento dei substrati, in inglese substrate o metabolic channeling, incanalamento che può avvenire anche attraverso veri e propri canali intramolecolari che connettono i siti attivi, come nel caso, tra i complessi enzimatici, del complesso della triptofano sintasi (EC 4.2.1.20), il cui tunnel fu il primo ad essere scoperto, e quello della carbamil fosfato sintetasi batterica (EC 6.3.4.16).
L’incanalamento dei substrati è in grado di aumentare la velocità di reazione, ma più in generale l’efficienza catalitica, in più modi, di seguito brevemente descritti.

  • Viene limitata al minimo la diffusione di substrati e prodotti nel mezzo circostante, quindi la loro diluizione e riduzione della concentrazione, producendo anzi elevate concentrazioni locali anche quando la loro concentrazione cellulare è bassa, il che porta ad un aumento della frequenza delle collisioni enzima-substrato.
  • Viene ridotto il tempo di transito dei substrati da un sito attivo al sito attivo successivo.
  • Viene ridotta la probabilità che si verifichino reazioni collaterali.
  • Gli intermedi chimicamente labili sono protetti dalla degradazione da parte del solvente.

Un altro vantaggio metabolico apportato dai complessi multienzimatici, analogamente a quanto accade con gli enzimi multifunzionali, è che consentono di controllare in modo coordinato l’attività catalitica degli enzimi che lo compongono. E se si aggiunge il fatto che spesso l’enzima che catalizza la prima reazione della sequenza è l’enzima regolatorio, è possibile evitare:

  • la sintesi di intermedi non necessari, altrimenti prodotti se la sequenza di reazioni fosse regolata a valle della prima reazione;
  • la sottrazione di metaboliti ad altre vie come pure uno spreco di energia.

Esempi di complessi multienzimatici

Da quanto detto in precedenza non sorprende che, specialmente nelle cellule eucariote, i complessi multienzimatici, al pari degli enzimi multifunzionali, siamo comuni e coinvolti in differenti vie metaboliche, sia anaboliche che cataboliche, mentre sono pochi gli enzimi liberamente diffusibili. Di seguito alcuni esempi.

Alfa-chetoacido deidrogenasi

Esempi classici di complessi multienzimatici sono i tre complessi appartenenti alla famiglia delle alfa-chetoacido deidrogenasi o 2-ossiacido deidrogenasi, ossia:

  • il complesso della piruvato deidrogenasi o PDC, acronimo dell’inglese pyruvate dehydrogenase complex;
  • il complesso dell’α-chetoacido deidrogenasi a catena ramificata o BCKDH , acronimo dell’inglese branched-chain α-keto acid dehydrogenase complex;
  • il complesso della α-chetoglutarato deidrogenasi, o 2-oxoglutarato deidrogenasi o OGDH, acronimo dell’inglese 2-oxoglutarate dehydrogenase.

I tre complessi sono correlati sia dal punto di vista strutturale che funzionale.
Considerando ad esempio il complesso della piruvato deidrogenasi questi è formato da copie multiple di tre enzimi differenti:

PDC, sia nei procarioti che negli eucarioti presenta quindi una struttura di base E1-E2-E3, struttura che si ritrova anche negli altri due complessi. In aggiunta, all’interno di una data specie:

E, sebbene questi enzimi siamo specifici per i rispettivi substrati,  utilizzano gli stessi cofattori, ossia il coenzima A, il NAD, al tiamina pirofosfato, il FAD e la lipoamide.
Al fine di differenziarle vengono indicate, per il complesso della piruvato deidrogenasi, della α-chetoglutarato deidrogenasi e della α-chetoacido deidrogenasi a catena ramificata, rispettivamente come:

  • E1p, E1o ed E1b (EC 1.2.4.4);
  • E3p, E3o, and E3b (EC 1.8.1.4).

Nota: il complesso della piruvato deidrogenasi degli eucarioti è il più grande complesso multienzimatico conosciuto, più grande di un ribosoma e visibile anche al microscopio elettronico.

Il complesso della piruvato deidrogenasi, che rappresenta il ponte di collegamento tra glicolisi e ciclo dell’acido citrico, catalizza la decarbossilazione ossidativa del piruvato, un α-chetoacido. Nel corso delle reazioni il gruppo carbossilico del piruvato viene rilasciato in forma di anidride carbonica (CO2) e si verifica il trasferimento del gruppo acetilico risultante al coenzima A a dare acetil-coenzima A. Inoltre sono rilasciati due elettroni che sono trasferiti al NAD+.

Complessi Multienzimatici
Fig. 1 – Le Cinque Reazioni Catalizzate da PDC

Anche nel corso delle reazioni catalizzate dal complesso della α-chetoglutarato deidrogenasi e dal complesso della α-chetoacido deidrogenasi a catena ramificata, rispettivamente quarta reazione del ciclo dell’acido citrico, ossia l’ossidazione dell’α-chetoglutarato a succinil-CoA, e l’ossidazione degli α-chetoacidi derivanti dal catabolismo degli amminoacidi a catena ramificata valina, leucina ed isoleucina, si verifica:

  • la liberazione del carbonio carbossilico dell’alfa-chetoacido in forma di CO2;
  • il trasferimento del gruppo acilico risultante al coenzima A a dare l’acil-CoA corrispondente;
  • la riduzione del NAD+ a NADH.

Dunque, la notevole somiglianza esistente tra le strutture proteiche, i cofattori richiesti ed i meccanismi di reazione riflettono senza dubbio una origine evolutiva comune.

Che cosa sono i chetoacidi?

I chetoacidi o ossiacidi sono composti organici contenenti due gruppi funzionali: un gruppo carbossilico ed uno chetonico. In base alla posizione del gruppo chetonico si possono individuare alfa-chetoacidi, beta-chetoacidi e gamma-chetoacidi.

  • Negli alfa-chetoacidi o 2-ossiacidi il gruppo chetonico è in posizione α (2) rispetto al carbonio carbossilico, ossia adiacente ad esso. Questi composti sono particolarmente importanti in biologia in quanto coinvolti nella glicolisi, l’acido piruvico, il più semplice degli α-chetoacidi, e nel ciclo dell’acido citrico, l’acido ossalacetico e l’acido α-chetoglutarico.
  • Nei beta-chetoacidi o 3-ossiacidi il gruppo chetonico è in posizione β (3) rispetto al carbonio carbossilico. Un esempio è l’acido acetoacetico, il più semplice tra i β-chetoacidi, e uno dei tre corpi chetonici, assieme all’acetone e l’acido β-idrossibutirrico, prodotti dall’epatocita nel caso in cui ci sia un eccesso di acetil-CoA, come durante il digiuno o diete povere di carboidrati.
  • Nei gamma-chetoacidi o 4-ossiacidi il gruppo chetonico è in posizione γ (4) rispetto al carbonio carbossilico. Un esempio è l’acido levulinico, il più semplice dei γ-chetoacidi, derivante dal catabolismo della cellulosa.
Chetoacidi
Fig. 2 – Chetoacidi

Triptofano sintasi

Il complesso della triptofano sintasi è uno degli esempi di incanalamento dei substrati meglio studiati. Presente nei batteri e nelle piante ma non negli animali, nei batteri è formato da due subunità α e due β assemblate in unità dimeriche αβ, che sembrano esser l’unità funzionale del complesso, a dare una struttura tetramerica αββα.
Il complesso catalizza gli ultimi due passaggi della sintesi del triptofano: dall’indolo-3-glicero fosfato, per azione di una liasi (EC 4.1.2.8) presente sulle subunità α, viene liberata una molecola di gliceraldeide-3-fosfato e l’indolo. L’indolo diffonde quindi verso il sito attivo presente sulla subunità β sfruttando un tunnel idrofobico di circa 30 Å che, in ciascuna coppia αβ, connette i due siti attivi. Nel sito attivo della subunità β avviene, in presenza del piridossal-5-fosfato, la condensazione tra l’indolo ed una serina a dare il triptofano.

Acetil-CoA carbossilasi

L’acetil-CoA carbossilasi o ACC (EC 6.4.1.2), membro della famiglia delle carbossilasi biotina-dipendenti, catalizza la prima tappa di comando della sintesi degli acidi grassi, ossia la carbossilazione dell’acetil-CoA a malonil-CoA, che è utilizzato come donatore di unità bicarboniose dalla acido grasso sintasi (EC 2.3.1.85) durante il processo di allungamento che porterà alla sintesi dell’acido palmitico.
Nei batteri ACC è un complesso multienzimatico composto da due enzimi, la biotina carbossilasi (EC 6.3.4.14) e una carbossitransferasi, cui si aggiunge una proteina trasportatrice della biotina o BCCP, acronimo dell’inglese biotin carboxyl-carrier protein.
Nei mammiferi e negli uccelli è invece un enzima multifunzionale, in quanto le due attività enzimatiche sono presenti su una stessa catena polipeptidica, nella quale si ritrova anche BCCP.
Nelle piante superiori sono presenti entrambe le forme.

Carbamil fosfato sintetasi

Altro esempio ben caratterizzato di incanalamento dei substrati è il complesso della carbamil fosfato sintetasi dei batteri, che catalizza la sintesi del carbamil fosfato, necessario sia per la sintesi delle pirimidine che per quella dell’arginina. Il complesso presenta un tunnel lungo circa 100 Å all’interno del quale si muovono i prodotti delle sue tre attività enzimatiche.
La prima catalizza la cessione dell’azoto ammidico della glutammina in forma di ione ammonio, il quale entra nel tunnel dove nel secondo sito attivo si combina con il bicarbonato, a spese di una molecola di ATP, a dare carbamato, che infine nell’ultimo sito attivo viene fosforilato a carbamil fosfato.

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