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Via del pentoso fosfato

La via del pentoso fosfato: contenuti in breve

Che cos’è la via del pentoso fosfato?

La via del pentoso fosfato, anche detta via del fosfogluconato, è una via metabolica, comune a tutti gli organismi viventi, per il metabolismo ossidativo del glucosio alternativa alla glicolisi da cui si ramifica a livello del glucosio-6-fosfato, e le cui funzioni principali sono la produzione, in rapporti variabili, di NADPH, un coenzima ridotto, e ribosio-5-fosfato, uno zucchero fosforilato a cinque atomi di carbonio, ossia un pentoso fosfato, da cui il nome della via.

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 1 – Via del Pentoso Fosfato

In aggiunta alla produzione di NADPH e ribosio-5-fosfato, questa via metabolica ha altre funzioni, sia anaboliche che cataboliche.

  • In molti batteri e nei lieviti è coinvolta nel catabolismo degli zuccheri a cinque atomi di carbonio ribosio, xilosio e arabinosio.
    Anche nell’uomo questa è coinvolta nel catabolismo dei suddetti pentosi e dei meno comuni zuccheri a tre, quattro e sette atomi di carbonio assunti con la dieta, nonché per il catabolismo dei:

pentosi derivanti dal catabolismo dei carboidrati strutturali;
ribosio-5-fosfato derivante dal catabolismo dei nucleotidi.

  • Negli organismi fotosintetici contribuisce all’incorporazione dell’anidride carbonica (CO2) nella molecola del glucosio nel corso del ciclo di Calvin.
  • Porta alla sintesi oltre che di ribosio-5-fosfato, anche di altri intermedi utilizzati in vari processi biosintetici come:

eritrosio-4-fosfato, utilizzato per la sintesi dei tre aminoacidi aromatici triptofano, tirosina e fenilalanina;
ribulosio-5-fosfato, utilizzato per la sintesi della riboflavina;
sedoeptulosio-7-fosfato che, nei batteri Gram-negativi, è utilizzato per la sintesi delle unità di eptosio dello strato lipopolisaccaridico della membrana esterna.

La via del fosfogluconato, ramificandosi dalla glicolisi, è anche detta shunt dell’esoso monofosfato, dove shunt può essere tradotto come derivazione o smistamento.

E’ stato stimato che più del 10% del glucosio metabolizzato è trasportato attraverso questa via metabolica che, degno di nota, pur ossidando il monosaccaride non comporta alcuna produzione diretta, ma neppure consumo, di ATP.

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La delucidazione della via del pentoso fosfato

Le prime evidenze dell’esistenza della via del fosfogluconato emersero negli anni trenta del secolo scorso dagli studi di Otto Warburg, premio Nobel per la Fisiologia o la Medicina nel 1931, che scoprì il NADP durante studi sull’ossidazione del glucosio-6-fosfato a 6-fosfogluconato.
Ulteriori indicazioni emersero dall’osservazione che nei tessuti il glucosio continuava ad essere metabolizzato anche in presenza di inibitori della glicolisi, quali gli ioni fluoruro e iodoacetato, inibitori rispettivamente della enolasi (EC 4.2.1.11) e della gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (EC 1.2.1.12).
Tuttavia la delucidazione completa della via avvenne solo negli anni cinquanta del secolo scorso grazie al lavoro di diversi ricercatori e principalmente dei gruppi di Efraim Racker, Fritz Lipmann, vincitore del premio Nobel per la Fisiologia o la Medicina nel 1953 anche grazie alla scoperta del coenzima A, Bernard Horecker e Frank Dickens.

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Funzioni del NADPH e del ribosio-5-fosfato

Il NADPH è necessario per le biosintesi riduttive, quali la sintesi degli acidi grassi, del colesterolo, degli ormoni steroidei e degli aminoacidi non essenziali prolina e tirosina, rispettivamente dal glutammato e dalla fenilalanina, nonché per la riduzione del glutatione ossidato. Nelle suddette reazioni il coenzima ridotto funge da donatore di elettroni, o meglio da donatore di uno ione idruro (:H), equivalente ad un protone e due elettroni.

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 2 – NADPH

Nota: nei vertebrati circa la metà del NADPH necessario per i passaggi riduttivi della sintesi degli acidi grassi deriva dalla via del pentoso fosfato, mentre la restante parte dalla reazione catalizzata dall’enzima malico (EC 1.1.1.40), di cui di seguito è indicata la reazione.

Malato + NADP+ ↔ Piruvato + NADPH + H+ + HCO3

Il ribosio-5-fosfato viene utilizzato nella sintesi dei nucleotidi e degli acidi nucleici, DNA ed RNA, dell’ATP, di coenzimi come il coenzima A, il NAD, il NADP ed il FAD, e degli aminoacidi essenziali triptofano ed istidina.

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 3 – Ribosio-5-fosfato

Lo zucchero fosforilato non viene utilizzato direttamente come tale ma previa conversione, attivazione, a 5-fosforibosil-1-pirofosfato o PRPP, acronimo dell’inglese 5-phosphoribosyl 1-pyrophosphate, nella reazione catalizzata dalla ribosio fosfato pirofosfochinasi o PRPP sintetasi (EC 2.7.6.1).

Ribosio-5-fosfato + ATP → 5-Fosforibosil-1-pirofosfato + AMP

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Dove avviene la via del pentoso fosfato?

Nelle cellule animali la via del pentoso fosfato, al pari della glicolisi, della sintesi degli acidi grassi, e della maggior parte delle reazioni della gluconeogenesi, avviene nel citosol, analogamente a quanto accade nei batteri. E, considerando glicolisi, gluconeogenesi e via del pentoso fosfato è possibile affermare che queste tre vie metaboliche sono collegate tra di loro tramite diversi enzimi e/o intermedi condivisi.
Nelle cellule vegetali la via del fosfogluconato avviene invece nei plastidi, ed i suoi intermedi possono raggiungere il citosol attraverso i pori di membrana di questi organelli.

Considerando invece la distribuzione tissutale nell’uomo, i livelli di espressione degli enzimi della via variano ampiamente da tessuto a tessuto.
Livelli relativamente elevati si ritrovano nel fegato, nella corteccia surrenale, nei testicoli e nelle ovaie, nella tiroide, nelle ghiandole mammarie durante l’allattamento e, nel sangue, nei globuli rossi. In tutte queste sedi è richiesto un apporto continuo di NADPH per sostenere le biosintesi riduttive e/o per contrastare gli effetti dei radicali liberi dell’ossigeno o ROS, acronimo dell’inglese reactive oxygen species, su strutture cellulari sensibili come il DNA, i lipidi di membrana e le proteine, attraverso la riduzione del glutatione ossidato (GSSG) nella reazione catalizzata dalla glutatione reduttasi (EC 1.8.1.7).

GSSG + NADPH + H+ → 2 GSH + NADP+

Nota: il glutatione è il principale antiossidante nei globuli rossi, come nella maggior parte della altre cellule. La molecola è un tripeptide, la g-glutammil-cisteinilglicina, che nello stato ridotto presenta nel residuo di cisteina un gruppo sulfidrilico (-SH), da cui l’abbreviazione GSH.

L’azione di contrasto sugli effetti dei ROS è particolarmente importante in cellule come i globuli rossi e le cellule della cornea e del cristallino che sono direttamente esposte all’ossigeno.
Elevati livelli degli enzimi di questa via metabolica sono presenti anche in cellule in rapida divisione quali quelle dell’embrione nelle prime fasi di sviluppo, gli enterociti, le cellule della pelle e del midollo osseo e, in condizioni patologiche, le cellule tumorali, tutte cellule che richiedono elevate quantità di ribosio-5-fosfato per la sintesi dei nucleotidi.
Di contro nel muscolo scheletrico sono presenti livelli estremamente bassi degli enzimi della via del pentoso fosfato, via che in questa sede è praticamente assente e dove il glucosio-6-fosfato è utilizzato principalmente per la produzione di energia attraverso la glicolisi ed il ciclo dell’acido citrico.

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Le due fasi della via del pentoso fosfato

Dal punto di vista concettuale, nella via del pentoso fosfato è possibile individuare due fasi.

  • Nella prima fase, la fase ossidativa, una molecola di glucosio-6-fosfato, uno zucchero fosforilato a 6 atomi di carbonio, viene convertita in una di ribulosio-5-fosfato, uno zucchero fosforilato a 5 atomi di carbonio, con la concomitante produzione di due molecole di NADPH e la liberazione del C-1 del glucosio in forma di CO2.
  • Nella seconda fase, la fase non ossidativa, viene prodotta una varietà di carboidrati fosforilati il cui destino dipende dalle necessità relative di NADPH, ribosio-5-fosfato e ATP da parte della cellula.

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Le tappe della fase ossidativa della via del pentoso fosfato

La fase ossidativa della via del fosfogluconato si compone di tre tappe, due ossidazioni irreversibili, rispettivamente la prima e la terza reazione, ed una idrolisi.

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 4 – Fase Ossidativa della Via del Pentoso Fosfato

Di seguito sono descritti i meccanismi di reazione e, per quanto riguarda la glucosio-6-fosfato deidrogenasi o G6PD, acronimo dell’inglese glucose 6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.1.49), anche la regolazione dell’attività enzimatica.

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Ossidazione del glucosio-6-fosfato a 6-fosfoglucono-δ-lattone

Nella prima tappa della fase ossidativa, il glucosio-6-fosfato viene ossidato a 6-fosfoglucono-δ-lattone, un estere intramolecolare, reazione catalizzata dalla glucosio-6-fosfato deidrogenasi.
Nella reazione il NADP+ funge da agente riducente accettando uno ione idruro dal carbonio 1 del glucosio-6-fosfato, e riducendosi quindi a NADPH.

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Fig. 5 – Glucosio-6-fosfato Deidrogenasi

Si noti che questa è la prima molecola di NADPH prodotta nella via del pentoso fosfato.

La reazione catalizzata dalla glucosio-6-fosfato deidrogenasi è una reazione “esclusiva” della via del pentoso fosfato. Analogamente a quanto accade nella maggior parte delle altre vie metaboliche, anche in questo caso, la prima reazione esclusiva della via è essenzialmente irreversibile, con un ΔG nel fegato pari a -4,21 kcal/mol (-17,6 kJ/mol), ed altamente regolata per via allosterica. L’enzima infatti rappresenta il principale punto di controllo del flusso di metaboliti attraverso la via stessa.
Nell’uomo i livelli più elevati di G6PD sono presenti nei neutrofili e macrofagi, cellule fagocitarie in cui, durante l’infiammazione, il NADPH viene utilizzato per la produzione di radicali superossido (O2.) dall’ossigeno molecolare nella reazione catalizzata dalla NADPH ossidasi (EC 1.6.3.1 ).

2 O2 + NADPH → 2 O2. + NADP+ + H+

Di seguito i radicali superossido potranno essere utilizzati per la sintesi, a scopi difensivi, ossia l’uccisione dei microrganismi fagocitati, di altri ROS come anche di radicali liberi dell’azoto o RNS, acronimo dell’inglese reactive nitrogen species, quali:

  • il perossido di idrogeno o acqua ossigenata (H2O2), nella reazione catalizzata dalla superossido dismutasi o SOD (EC 1.15.1.1)

2 O2. + 2 H+ → H2O2 + O2

  • il perossinitrito (O=N–O–O), a seguito della reazione con il monossido di azoto (·NO)

O2. + ·NO → O=N–O–O

  • il radicale idroperossido (HOO·)

O2. + H+ → HOO·

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Meccanismo catalitico della glucosio-6-fosfato deidrogenasi

Il meccanismo catalitico dell’enzima è stato ampiamente studiato nel microorganismo Leuconostoc mesenteroides, la cui glucosio-6-fosfato deidrogenasi ha la peculiare caratteristica di poter utilizzare come coenzima il NAD+ e/o il NADP+.

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 6 – G6PD: Meccanismo Catalitico

L’enzima non necessita della presenza di ioni metallici per la propria attività; uno dei residui presenti nel sito attivo funge da base generale, ossia è in grado di estrarre uno ione idruro dal gruppo ossidrilico legato al C-1 del glucosio-6-fosfato.
Nell’enzima batterico questo è effettuato dall’atomo Nɛ2 dell’anello imidazolico della catena laterale di un residuo di istidina, azoto che presenta un doppietto elettronico disponibile portare un l’attacco nucleofilo. Questa fa si che il glucosio-6-fosfato, un emiacetale ciclico con il C-1 nello stato di ossidazione aldeidico, sia ossidato ad estere ciclico, ossia un lattone. Ciò consente il trasferimento dello ione idruro legato al C-1 del glucosio sul C-4 dell’anello nicotinamidico del NADP+ a dare NADPH.
Poiché l’istidina suddetta è conservata in molte delle glucosio-6-fosfato deidrogenasi sequenziate, è probabile che questo meccanismo catalitico sia generalizzabile a tutte le glucosio-6-fosfato deidrogenasi.

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Regolazione della glucosio-6-fosfato deidrogenasi

La glucosio-6-fosfato deidrogenasi rappresenta l’enzima chiave nella regolazione del flusso metabolico attraverso la via del pentoso fosfato, e quindi il principale punto di controllo della velocità di produzione del NADPH.
Nell’uomo l’enzima è presente in due forme: quella monomerica, inattiva, e in un equilibrio tra una forma dimerica ed una tetramerica, le conformazioni attive.
Uno dei principali modulatori della sua attività è il rapporto citosolico NADP+/NADPH. Elevati livelli di NADPH inibiscono l’enzima poiché il coenzima ridotto è un potente inibitore competitivo della G6PD, mentre il NADP+ è necessario sia per la sua attività catalitica che per il mantenimento della conformazione attiva. Infatti il legame del coenzima ossidato ad un sito specifico, distante dal sito attivo ma vicino all’interfaccia del dimero, è necessario per mantenerne la conformazione dimerica.

Fig. 7 – Regolazione dell’Attività della G6PD

Nella maggior parte delle condizioni metaboliche il rapporto NADP+/NADPH è basso, meno NADP+ è disponibile per legarsi all’enzima e di conseguenza si riduce l’attività dell’enzima stesso, a prescindere dai livelli della sua espressione genica. In queste condizioni la fase ossidativa è praticamente inattiva.
Se invece si considerano cellule in cui siano particolarmente attive vie metaboliche e/o reazioni che utilizzano NADPH, si verifica la riduzione della sua concentrazione citosolica, un aumento di quella del NADP+ e quindi una stimolazione dell’attività dell’enzima. Ne consegue un’attivazione della fase ossidativa della via dell’esoso monofosfato.
Quindi è anche possibile affermare che il destino del glucosio-6-fosfato, un intermedio comune alla glicolisi e alla via del fosfogluconato, dipende anche dal fabbisogno contingente di NADPH.
Un secondo meccanismo di regolazione dell’attività della glucosio-6-fosfato deidrogenasi chiama in causa l’accumulo di acil-CoA, intermedi nella sintesi degli acidi grassi. Queste molecole, legandosi alla forma dimerica dell’enzima ne causano la dissociazione nei due monomeri costitutivi, e quindi la perdita dell’attività catalitica.
L’insulina up-regola l’espressione del gene per la glucosio-6-fosfato deidrogenasi e per la 6-fosfogluconato deidrogenasi, per cui l’ormone, nello stato ben alimentato, concorre ad aumentare il flusso di carbonio attraverso la via del pentoso fosfato, promuovendo quindi la sintesi di NADPH.
Nota: l’insulina promuove anche la sintesi degli acidi grassi.

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Idrolisi del 6-fosfoglucone-δ-lattone a 6-fosfogluconato

Nella seconda tappa della fase ossidativa si verifica l’idrolisi del 6-fosfoglucone-δ-lattone a dare il 6-fosfogluconato, una molecola lineare. Il 6-fosfoglucone-δ-lattone è di per se idroliticamente instabile e va incontro ad una idrolisi spontanea che apre l’anello, reazione che avviene ad una velocità significativa. Tuttavia nella cellula la reazione è accelerata dall’azione catalitica di una specifica lattonasi (EC 3.1.1.31).

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Fig. 8 – Lattonasi

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Decarbossilazione ossidativa del 6-fosfogluconato a ribulosio-5-fosfato

Nella terza tappa della fase ossidativa si verifica la decarbossilazione ossidativa del 6-fosfogluconato a dare ribulosio-5-fosfato, un cheto pentoso, una molecola di CO2 e una di NADPH. La reazione è catalizzata dalla 6-fosfogluconato deidrogenasi (EC 1.1.1.44), enzima che richiede la presenza di ioni magnesio, Mg2+.

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Fig. 9 – 6-Fosfogluconato Deidrogenasi

Si noti che questa è la seconda molecola di NADPH prodotta nella via del pentoso fosfato.

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Meccanismo catalitico della 6-fosfogluconato deidrogenasi

Il meccanismo catalitico, simile a quello dell’enzima del ciclo dell’acido citrico isocitrico deidrogenasi (EC 1.1.1.41), consiste in una catalisi acido/base e procede attraverso tre passaggi in cui sono coinvolti in particolare due residui conservati presenti nel sito attivo, una lisina (Lys) ed un glutammato (Glu), nell’uomo rispettivamente la Lys185 e il Glu192. La lisina agisce sia come  acido che come base mentre il glutammato come acido.

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Fig. 10 – 6-Fosfogluconato Deidrogenasi: Meccanismo Catalitico

Nel primo passaggio, il passaggio ossidativo, il 6-fosfogluconato viene ossidato in un β-cheto acido, il 3-cheto-6-fosfogluconato.
In questo passaggio l’ε-amino gruppo della catena laterale del suddetto residuo di lisina funge da base, da nucleofilo, estraendo un protone dal gruppo ossidrilico legato sul C-3, cui segue il trasferimento dello ione idruro legato al C-3 sul C-4 dell’anello nicotinamidico del NADP+. In questo modo si viene a formare il 3-cheto intermedio ed una molecola di NADPH che lascia il sito attivo.
Nel secondo passaggio, il passaggio decarbossilativo, il 3-cheto-6-fosfogluconato, che è estremamente suscettibile a decarbossilazione, perde, in forma di CO2, il C-1 del glucosio-6-fosfato a dare il cis-1,2-enediolo del ribulosio-5-fosfato, un intermedio ad elevata energia. In questo passaggio la lisina agisce come acido donando un protone all’ossigeno carbonilico legato al C-3.
Infine l’enzima catalizza una conversione stereospecifica enolo-chetone con formazione del ribulosio-5-fosfato. In questo passaggio il residuo di acido glutammico suddetto funge da acido donando un protone al C-1 del cis-1,2-enediolo, mentre l’ε-amino gruppo della lisina accetta un protone dal gruppo ossidrilico legato sul C-2. Il risultato è la formazione del ribulosio-5-fosfato.

Nota: un enediolo è un composto organico contenente due atomi di carbonio uniti da un doppio legame ed un gruppo ossidrile (-OH) legato ad ognuno dei due atomi di carbonio. L’enediolo può avere configurazione cis o trans.

Fig. 11 – Enedioli: Configurazioni Cis e Trans

Ad esempio, nel mondo vegetale molti polifenoli possiedono strutture enedioliche.

Dunque, la fase ossidativa della via del pentoso fosfato termina con la produzione del ribulosio-5-fosfato che è il substrato di partenza per le reazioni della fase non ossidativa.
L’equazione complessiva della fase ossidativa è:

3 Glucosio-6-fosfato + 6 NADP+ + H2O  → 6 NADPH + 6 H+ + 3 CO2 + 3 Ribulosio-5-fosfato

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Le tappe della fase non ossidativa della via del pentoso fosfato

La fase non ossidativa della via si compone di cinque tappe, tutte facilmente reversibili, nel corso delle quali si verifica una serie di interconversioni di zuccheri fosforilati.
Questa fase ha inizio con due possibili reazioni a carico del ribulosio-5-fosfato: una isomerizzazione e una epimerizzazione che portano alla formazione rispettivamente di ribosio-5-fosfato e xilulosio-5-fosfato.

Nota: le reazioni enzimatiche di isomerizzazione ed epimerizzazione svolgono un ruolo importante nel metabolismo dei carboidrati.
Le Epimerasi (EC 5.1), un sottogruppo delle Isomerasi (EC 5.), catalizzano l’inversione reversibile della configurazione di un atomo di carbonio asimmetrico, in genere attraverso la rimozione e l’aggiunta di un atomo di idrogeno.
Nelle reazioni di isomerizzazione lo scambio di gruppi chimici si verifica tra atomi di carbonio.

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Isomerizzazione del ribulosio-5-fosfato a ribosio-5-fosfato

Nella reazione di isomerizzazione il ribulosio-5-fosfato, un chetoso, viene convertito nell’aldoso corrispondente, il ribosio-5-fosfato. La reazione è catalizzata dalla fosfopentoso isomerasi o ribosio-5-fosfato isomerasi (EC 5.3.1.6).

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Fig. 12 – Fosfopentoso Isomerasi

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Meccanismo catalitico della ribosio-5-fosfato isomerasi

Il meccanismo catalitico, simile a quello dell’enzima glicolitico fosfoglucosio isomerasi (EC 5.3.1.9), procede attraverso la formazione dell’intermedio ad alta energia cis-1,2-enediolo del ribulosio-5-fosfato. La formazione del cis-1,2-enediolo è conseguente ad un meccanismo di trasferimento protonico comune alle isomerizzazione aldoso-chetoso.
Di seguito viene descritto il possibile meccanismo catalitico dell’enzima di E. coli nella direzione della formazione del ribulosio-5-fosfato dal ribosio-5-fosfato, che è anche la direzione seguita nel ciclo di Calvin della fotosintesi.

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Fig. 13 – Fosfopentoso Isomerasi: Meccanismo Catalitico

Il primo passaggio consiste nell’apertura dell’anello furanosico del ribosio-5-fosfato, apertura rara in soluzione acquosa (<0.5%), ed indotta dall’interazione con un residuo di acido aspartico (Asp81) che accetta un protone dal gruppo idrossilico legato al C-1, mentre è probabile che sia l’acqua il donatore di un protone.
Una volta aperta la catena un residuo di acido glutammico (Glu103) funge da base generale, da nucleofilo, estraendo il protone legato sul C-2, mentre Asp81 dona un protone. Come risultato si forma il cis-1,2-enediolo.
Di seguito, la base iniziale, Glu103 adesso protonata, funge da acido e dona un protone al C-1 dell’intermedio enediolico, mentre Asp81 funge da base generale accettando un protone dal gruppo ossidrilico legato al C-2. Il risultato è la formazione del ribulosio-5-fosfato.

Il meccanismo di reazione per la sintesi del ribosio-5-fosfato dal ribulosio-5-fosfato è semplicemente l’inverso di quanto appena descritto.

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Epimerizzazione del ribulosio-5-fosfato a xilulosio-5-fosfato

L’altro destino metabolico del ribulosio-5-fosfato nella via del pentoso fosfato è quello di essere epimerizzato a xilulosio-5-fosfato, un chetoso come il ribulosio-5-fosfato, nella reazione catalizzata dalla fosfopentoso epimerasi (EC 5.1.3.1).

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Fig. 14 – Fosfopentoso Epimerasi

Nota: lo xilulosio-5-fosfato, oltre ad essere un intermedio della via del pentoso fosfato ha anche azione regolatoria: stimola la glicolisi ed inibisce la gluconeogenesi, intervenendo nel controllo della concentrazione del fruttosio-2,6-bisfosfato nel fegato.

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Meccanismo catalitico della fosfopentoso epimerasi

Anche questa reazione, come quelle catalizzate dalla 6-fosfogluconato deidrogenasi e dalla ribosio-5-fosfato isomerasi, procede attraverso la formazione di un intermedio enediolico, ma con il doppio legame non tra i carboni 1 e 2  ma tra quelli 2 e 3.
Quello che accade nel corso della reazione è che un residuo aminoacidico presente nel sito attivo dell’enzima funge da base generale, da nucleofilo, ed estrae un protone dal C-3, il che porta alla formazione dell’intermedio cis-2,3-enediolico. Di seguito un residuo aminoacidico acido dona un protone al C-3, ma sul lato opposto, e dunque determinando l’inversione della configurazione sul C-3 a formare lo xilulosio-5-fosfato.

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Fig. 15 – Fosfopentoso Epimerasi: Meccanismo Catalitico

Arrivati a questo punto la via dell’esoso monofosfato ha portato alla formazione, per ogni molecola di glucosio-6-fosfato metabolizzata, di:

  • un pool di tre pentoso-5-fosfati, ossia ribulosio-5-fosfato, ribosio-5-fosfato e xilulosio-5-fosfato, che coesistono all’equilibrio;
  • 2 molecole di NADPH.

Nelle tre tappe successive, dalla sesta all’ottava, la  transchetolasi (EC 2.2.1.1) e la transaldolasi (EC 2.2.1.2), enzimi esclusivi della via del pentoso fosfato, catalizzano una serie di riarrangiamenti degli scheletri carboniosi che porteranno alla formazione di unità carboniose a tre, quattro, sei e sette atomi che potranno essere utilizzate per vari scopi metabolici, a seconda delle necessità della cellula.
In termini di analisi dei flussi di metaboliti tra le differenti vie metaboliche, l’azione concertata della transchetolasi e della transaldolasi permette l’interazione della via del pentoso fosfato, in particolare la sua fase non ossidativa, con la glicolisi, e la gluconeogenesi, nonché con le vie che portano alla formazione di numerose vitamine, coenzimi e precursori degli acidi nucleici.

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La Transchetolasi: tappe 6 e 8

La transchetolasi è l’enzima che catalizza la tappa limitante della fase non ossidativa della via del pentoso fosfato, ed il primo enzima che agisce a valle delle reazioni catalizzate dalla ribosio-5-fosfato isomerasi e della fosfopentoso epimerasi.
Scoperta indipendentemente nel 1953 da Horecker e Racker, e così chiamata da quest’ultimo, catalizza, nella sesta ed ottava tappa, il trasferimento di unità a due atomi di carbonio da un donatore chetoso, ossia lo xilulosio-5-fosfato, il sedoeptulosio-7-fosfato o il fruttosio-6-fosfato, ad un aldoso accettore, ribosio-5-fosfato, gliceraldeide-3-fosfato o eritrosio-4-fosfato.

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Fig. 16 – Transchetolasi: Reazione Generale

Considerando come esempi le reazioni “in avanti”, nella sesta tappa il chetoso donatore è lo xilulosio-5-fosfato mentre l’aldoso accettore è il ribosio-5-fosfato, a formare gliceraldeide-3-fosfato, il frammento a tre atomi di carbonio rimanente dello xilulosio-5-fosfato, e sedoeptulosio-7-fosfato, uno zucchero fosforilato a sette atomi di carbonio che sarà utilizzato nel passaggio successivo, il settimo;

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Fig. 17 – Transchetolasi: Sesta Tappa

Nell’ottava tappa il chetoso donatore è lo xilulosio-5-fosfato mentre l’aldoso accettore è l’eritrosio-4-fosfato, a dare una seconda molecola di gliceraldeide-3-fosfato ed una di fruttosio-6-fosfato.

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Fig. 18 – Transchetolasi: Ottava Tappa

Da notare che tre dei quattro prodotti delle reazioni catalizzate dalla transchetolasi, due molecole di gliceraldeide-3-fosfato ed una di fruttosio-6-fosfato, sono anche intermedi della glicolisi.

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Transchetolasi e tiamina pirofosfato

La transchetolasi appartiene al gruppo degli enzimi che richiedono la tiamina pirofosfato o TPP, acronimo dell’inglese thiamine pyrophosphate, come cofattore.
La tiamina pirofosfato è la forma biologicamente attiva della tiamina o vitamina B1, ed è saldamente legata all’enzima.

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Fig. 19 – Tiamina Pirofosfato

Altri enzimi che richiedono la TPP come cofattore sono:

  • la piruvato decarbossilasi (EC 4.1.1.1), che interviene nella fermentazione alcolica;
  • la componente piruvato deidrogenasi o subunità E1 (EC 1.2.4.1) del complesso della piruvato deidrogenasi;
  • la componente α-chetoacido deidrogenasi o subunità E1 (EC 1.2.4.4) del complesso della α-chetoacido deidrogenasi dei chetoacidi a catena ramificata;
  • la componente 2-chetoglutarato deidrogenasi o subunità E1 (EC 1.2.4.2) del complesso della α-chetoglutarato deidrogenasi, enzima del ciclo dell’acido citrico.

La funzione della tiamina pirofosfato è quella di contribuire al trasferimento di intermedi aldeidici attivati stabilizzando il carbanione a due atomi di carbonio che si forma durante la reazione.

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Meccanismo catalitico della transchetolasi

L’atomo di carbonio compreso tra l’atomo di zolfo e quello di azoto dell’anello tiazolico della tiamina pirofosfato, ossia l’atomo C-2, è molto più acido rispetto alla maggior parte dei gruppi =C- presenti in altre molecole a causa dell’adiacente atomo di azoto caricato positivamente che stabilizza elettrostaticamente il carbanione derivante dalla dissociazione del protone. Questo fa si che l’atomo di idrogeno ad esso legato sia facilmente dissociabile a formare un carbanione, ossia un atomo di carbonio con carica negativa. L’estrazione del protone è catalizzata dalla transchetolasi
Il carbanione reagisce con il carbonio carbonilico del substrato chetonico, nella tappa 6 lo xilulosio-5-fosfato o il sedoeptulosio-7-fosfato nella reazione in direzione opposta, oppure, considerando la tappa 8, di nuovo lo xilulosio-5-fosfato o il fruttosio-6-fosfato nella reazione in direzione opposta.
Prendendo come esempio la reazione “in avanti” della tappa 6, il composto di addizione tra la tiamina pirofosfato e lo xilulosio-5-fosfato va incontro a frammentazione a seguito della scissione del legame C2-C3 dello xilulosio-5-fosfato, a dare gliceraldeide-3-fosfato, che è rilasciata, e un’unità a due atomi di carbonio, un gruppo idrossietilico con carica negativa, che rimane legato al C-2 dell’anello tiazolico.

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 20 – Transchetolasi: Meccanismo Catalitico

La carica negativa presente sull’intermedio idrossietilico, ossia l’intermedio carbanionico, viene stabilizzata dall’anello tiazolico della tiamina pirofosfato grazie alla presenza dell’atomo di azoto carico positivamente che funge da “trappola” o “pozzo” per gli elettroni. Quindi l’anello tiazolico fornisce una struttura elettron deficiente o elettrofila nella quale gli elettroni del carbanione possono delocalizzarsi per risonanza.
Nell’ultimo passaggio si verifica la condensazione tra il gruppo idrossietilico e il ribosio-5-fosfato, l’aldeide accettore, attraverso l’attacco del carbanione sul carbonio aldeidico del ribosio-5-fosfato, a formare un addotto covalente legato alla tiamina pirofosfato.
La successiva scissione dell’addotto porta alla liberazione di sedoeptulosio-7-fosfato, rigenerando il carbanione della tiamina pirofosfato.

Nota: la transchetolasi può utilizzare come substrati, oltre allo xilulosio-5-fosfato, al sedoeptulosio-7-fosfato e al fruttosio-6-fosfato anche altri 2-chetozuccheri nonché diversi altri aldoso fosfati, agendo in modo simile a quanto appena visto.

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Carbanioni e carbocationi

Un carbanione è una specie chimica  contenente un carbonio trivalente con carica negativa.
Si tratta di un intermedio di reazione estremamente reattivo, derivante dalla rottura eterolitica di un legame tra un atomo di carbonio ed un altro atomo o gruppo.
I carbanioni, disponendo di una coppia elettronica non condivisa, sono dei potenti nucleofili, e delle basi forti, ed attaccano, al fine di formare un legame covalente, un protone o un centro elettrofilo, come un centro polarizzato o carico positivamente. Data la loro forte reattività, con l’esclusione di poche eccezioni, sono intermedi transienti nelle reazioni organiche, al pari dei radicali liberi e dei carbocationi.
Un carbocatione è una specie chimica  contenente un carbonio trivalente con carica positiva. Al pari dei radicali liberi, i carbocationi sono specie caratterizzate da una lacuna elettronica, avendo nell’orbitale di valenza non otto elettroni ma solo sei elettroni. I radicali liberi invece presentano nell’orbitale di valenza sette elettroni. A causa di questa lacuna elettronica entrambe le specie sono potenti elettrofili, e, al pari dei carbanioni, sono intermedi di reazione estremamente reattivi. Nel corso delle reazioni accettano elettroni, uno i radicali liberi, due i carbocationi, al fine di raggiungere la struttura elettronica stabile dell’ottetto.

Considerando due atomi legati da un legame covalente, esistono due possibili modi per rompere suddetto legame: l’omolisi e l’eterolisi.

  • Nell’omolisi, a seguito della rottura del legame, ciascun atomo prende uno dei due elettroni di legame. Le due molecole formatesi hanno quindi un numero dispari di elettroni, ossia un elettrone spaiato, e sono senza carica; tali specie sono definite radicali liberi.
  • Nell’eterolisi la rottura del legame porta invece alla formazione di due molecole dotate di carica, ossia due ioni, un catione ed un anione, in quanto entrambe gli elettroni di legame sono presi da una delle due specie prodotte.
Via del Pentoso Fosfato
Fig. 21 – Omolisi ed Eterolisi

Nota: la scissione eterolitica è più comune di quella omolitica.

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La transaldolasi: tappa 7

La transaldolasi, scoperta nel 1953 da Horecker e Smyrniotis nel lievito Saccharomyces cerevisiae, interviene nella settima tappa della via del pentoso fosfato dove catalizza il trasferimento di una unità a tre atomi di carbonio da un substrato donatore, il sedoeptulosio-7-fosfato, ad un substrato accettore, la gliceraldeide-3-fosfato, a dare fruttosio-6-fosfato ed eritrosio-4-fosfato.

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 22 – Transaldolasi

Da notare che, in analogia con quanto visto per le reazioni catalizzate dalla transchetolasi, anche in questo caso il donatore dell’unità carboniosa trasferita è un chetoso mentre l’accettore è un aldoso.
Nella reazione in direzione opposta il chetoso donatore sarà il fruttosio-6-fosfato mentre l’aldoso accettore l’eritrosio-4-fosfato.

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Meccanismo catalitico della transaldolasi

A differenza della transchetolasi, la transaldolasi non necessita per la propria attività della presenza di cofattori.
La reazione si compone di una parte equivalente ad una scissione aldolica e di una equivalente ad una condensazione aldolica. Di seguito verrà analizzato il meccanismo di catalitico della transaldolasi B di E. coli, considerando la reazione nella direzione della formazione dell’eritrosio-4-fosfato e del fruttosio-6-fosfato.
Nel primo passaggio l’ε-amino gruppo della catena laterale di un residuo di lisina (Lys132) presente nel sito attivo, a seguito del trasferimento di un protone ad un residuo di acido glutammico (Glu96), trasferimento mediato da una molecola d’acqua, porta un attacco nucleofilo al C-2 del sedoeptulosio-7-fosfato, il carbonio carbonilico. Il risultato è la formazione di una carbinolammina con il sedoeptulosio-7-fosfato.

Via del Pentoso Fosfato
Fig. 23 – Transaldolasi: Meccanismo Catalitico

Segue la perdita di una molecola d’acqua dalla carbinolammina con formazione di una immina, o base di Schiff, legata all’enzima; anche in questo passaggio interviene il trasferimento di un protone da Glu96 alla molecola d’acqua “catalitica”.
Nota: l’intermedio covalente enzima-substrato che si è formato è simile a quello che quello che si forma nella reazione catalizzata dalla aldolasi (EC 4.1.2.13) nella quarta tappa della glicolisi.
Nel passaggio successivo, il gruppo carbossilico di un residuo di acido aspartico (Asp17) estrae un protone dal gruppo idrossilico legato sul C-4, con conseguente rottura del legame covalente tra C-3 e C-4, una scissione aldolica che porta alla liberazione dell’aldoso eritrosio-4-fosfato, il primo prodotto della reazione, mentre rimane legato all’enzima un carbanione a tre atomi di carbonio che è stabilizzato per risonanza, analogamente a quanto visto per la transchetolasi. Infatti, al pari dell’atomo di azoto dell’anello tiazolico della tiamina pirofosfato, anche l’atomo di azoto con carica positiva della base di Schiff agisce da trappola per gli elettroni stabilizzando la carica negativa del carbanione.
Una volta che il secondo substrato, la gliceraldeide-3-fosato, si trova in posizione nel sito attivo, il carbanione porta un attacco nucleofilo al carbonio carbonilico della gliceraldeide-3-fosfato a formare, mediante una condensazione aldolica, un nuovo legame C-C e un chetoso legato all’enzima.
Infine l’idrolisi della base di Schiff porta al rilascio del fruttosio-6-fosfato, un chetoso ed il secondo prodotto della reazione, e permette l’inizio di un nuovo ciclo di reazione.

A questo punto, come visto in precedenza, nell’ottava tappa della via del pentoso fosfato, interviene nuovamente la transchetolasi che catalizza la formazione di fruttosio-6-fosfato e glicealdeide-3-fosfato a partire da eritrosio-4-fosfato e xilulosio-5-fosfato.

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Regolazione della via del pentoso fosfato

Il glucosio-6-fosfato è un metabolita che può entrare sia nella glicolisi che nella via del pentoso fosfato a seconda dei fabbisogni relativi di ATP, NADPH e ribosio-5-fosfato da parte della cellula.
Nel caso di un aumentato fabbisogno di ATP, la maggior parte del glucosio-6-fosfato sarà incanalata nella via glicolitica.
Se invece sono aumentati i fabbisogni di NADPH e/o ribosio-5-fosfato, la maggior parte dello zucchero fosforilato sarà incanalato nella via del pentoso fosfato.
Dal punto di vista molecolare il destino del glucosio-6-fosfato dipende in larga parte dalle attività relative degli enzimi che lo metabolizzano nella via glicolitica e nello shunt dell’esoso monofosfato, rispettivamente la fosfofruttochinasi-1 o PFK-1,  acronimo dell’inglese phosphofructokinase-1 (EC 2.7.1.11), e la glucosio-6-fosfato deidrogenasi, enzimi la cui attività è altamente regolata.

Nota: sebbene nella via glicolitica il glucosio-6-fosfato sia substrato della fosfoglucosio isomerasi, questo enzima catalizza la sua isomerizzazione reversibile in fruttosio-6-fosfato, quest’ultimo substrato della fosfofruttochinasi-1.

La PFK-1 è inibita quando aumenta la concentrazione dell’ATP e/o di citrato, ossia quando la carica energetica della cellula è alta, mentre è attivata quando aumenta la concentrazione dell’AMP e/o del fruttosio-2,6-bisfosfato, ossia quando la carica energetica della cellula è bassa. Ne consegue che, quando la carica energetica della cellula è alta il flusso di carbonio, e quindi di glucosio-6-fosfato, attraverso la glicolisi si riduce.
La glucosio-6-fosfato deidrogenasi è invece inibita dal NADPH e dagli acil-CoA, intermedi nella biosintesi degli acidi grassi. Se quindi la concentrazione citosolica del NADPH aumenta il flusso di glucosio-6-fosfato attraverso la via del pentoso fosfato è inibito. Viceversa, se i livelli di NADPH cadono, l’inibizione viene meno, la via si “riaccende” e vengono sintetizzati NADPH e ribosio-5-fosfato.

Tuttavia, anche quando la glucosio-6-fosfato deidrogenasi è attiva, la cellula è ancora in grado di rispondere al quelle che sono le necessità relative di NADPH, ribosio-5-fosfato ed ATP regolando di conseguenza il flusso di carbonio attraverso la via del fosfogluconato. E, in base alle necessità della cellula di NADPH, ribosio-5-fosfato ed ATP, quello che accadrà è una “combinazione” di alcune reazioni della via glicolitica, della gluconeogenesi e della via del pentoso fosfato al fine di sintetizzare i metaboliti richiesti, sfruttando anche il fatto che la fase non ossidativa dello shunt dell’esoso monofosfato è controllata essenzialmente dalla disponibilità dei substrati.
Di seguito sono analizzate le quattro principali possibilità.

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Il fabbisogno di NADPH è molto maggiore di quello di ribosio-5-fosfato e ATP

Quando il fabbisogno di NADPH è molto maggiori di quello di ribosio-5-fosfato e la cellula non ha bisogno di ulteriore produzione di ATP, ossia la carica energetica della cellula è alta, il glucosio-6-fosfato entra nella via del pentoso fosfato e può essere completamente ossidato a CO2. Una condizione metabolica del genere si ritrova ad esempio nel tessuto adiposo nel corso di una intensa sintesi di acidi grassi.
Nella fase ossidativa della via, per ogni molecola di glucosio-6-fosfato ossidata a ribulosio-5-fosfato, sono prodotte due molecole di NADPH. Attraverso una combinazione delle reazione della fase non ossidativa e di alcune reazioni della gluconeogenesi, nello specifico quelle catalizzate dagli enzimi  trioso fosfato isomerasi (EC 5.3.1.1), aldolasi (EC 4.1.2.13), fosfoglucosio isomerasi (EC 5.3.1.9), e fruttosio-1,6-bisfosfatasi (EC 3.1.3.11), sei molecole di ribulosio-5-fosfato vengono convertite in cinque di glucosio-6-fosfato. E’ quindi anche possibile affermare che le reazioni della fase non ossidativa permettono alle reazioni della fase ossidativa di procedere.
In questo processo è possibile individuare tre gruppi di reazioni che operano in sequenza.

  • Nel primo gruppo si ritrovano le reazioni catalizzate dagli enzimi della fase ossidativa, e si ha la formazione di due molecole di NADPH ed una di ribulosio-5-fosfato.

6 Glucosio-6-fosfato + 12 NADP+ + 6 H20 → 6 Ribulosio-5-fosfato + 6 CO2 + 12 NADPH + 12 H+

6 Ribulosio-5-fosfato → 4 Fruttosio-6-fosfato + 2 Gliceraldeide-3-fosfato

  • Infine, attraverso le suddette reazioni della gluconeogenesi il fruttosio-6-fosfato e la gliceraldeide-3-fosfato sono “riciclati” a glucosio-6-fosfato, di modo che il ciclo possa ricominciare.

4 Fruttosio-6-fosfato + 2 Gliceraldeide-3-fosfato + H2O → 5 Glucosio-6-fosfato + Pi

Sommando le ultime due reazioni si evince che sei molecole di ribulosio-5-fosfato sono convertite in cinque di glucosio-6-fosfato.

6 Ribulosio-5-fosfato + H2O → 5 Glucosio-6-fosfato + Pi

Dalla somma delle reazioni del primo, secondo e terzo gruppo si ottiene la reazione complessiva:

Glucosio-6-fosfato + 12 NADP+ + 7 H20 → 6 CO2 + 12 NADPH + 12 H+ + Pi

Dunque, una molecola di glucosio-6-fosfato, attraverso sei cicli della via del pentoso fosfato accoppiati con alcune reazioni della reazioni gluconeogenesi, sarà convertita in 6 molecole di CO2, con la concomitante produzione di 12 molecole di NADPH, ma nessuna produzione netta di ribosio-5-fosfato.

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Il fabbisogno di NADPH ed ATP è molto maggiore di quello di ribosio-5-fosfato

Quando il fabbisogno di NADPH è molto maggiore di quello di ribosio-5-fosfato e la carica energetica della cellula è bassa, ossia la cellula necessita di ATP, il ribulosio-5-fosfato prodotto nella fase ossidativa viene convertito in fruttosio-6-fosfato e gliceraldeide-3-fosfato attraverso le reazioni della fase non ossidativa. Di seguito i due intermedi, attraverso le reazioni della glicolisi, sono ossidati a piruvato con concomitante produzione di ATP.
La reazione complessiva è:

3 Glucosio-6-fosfato + 6 NADP+ + 5 NAD+ + 5 Pi + 8 ADP → 5 Piruvato + 3 CO2 + 6 NADPH + 5 NADH + 8 ATP + 2 H2O + 8 H+

Se la cellula necessita di altro ATP, il piruvato prodotto potrà essere ossidato attraverso il ciclo dell’acido citrico. Se invece non è necessario produrre ulteriore ATP, il piruvato potrà essere utilizzato come precursore in diverse vie biosintetiche.

Da notare che anche in questo caso, come nel precedente, non si verifica alcuna produzione netta di ribosio-5-fosfato.

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Il fabbisogno di ribosio-5-fosfato è molto maggiore di quello di NADPH

Quando il fabbisogno di ribosio-5-fosfato è molto maggiore rispetto a quello di NADPH, come nelle cellule che si dividono rapidamente, nelle quali è quindi in corso una rapida sintesi di nucleotidi precursori del DNA, le reazioni della fase ossidativa della via del pentoso fosfato non hanno luogo, e non vi è sintesi di NADPH. Al contrario, poiché le reazioni della fase non ossidativa sono facilmente reversibili, la riduzione della concentrazione del ribosio-5-fosfato, causata dal suo rapido utilizzo, avrà come effetto quello di stimolarne la sintesi.
Quello che accade è che, attraverso la via glicolitica, molto del glucosio-6-fosfato viene convertito in fruttosio-6-fosfato e gliceraldeide-3-fosfato. A questo punto la transaldolasi e la transchetolasi portano alla sintesi di ribosio-5-fosfato e xilulosio-5-fosfato. Quest’ultimo, attraverso le reazione catalizzate dalla fosfotopentoso epimerasi e di seguito dalla ribosio-5-fosfato isomerasi, verrà convertito in ribosio-5-fosfato.
La reazione complessiva è:

6 Glucosio-6-fosfato + ATP → 6-Ribosio-5-fosfato + ADP + H+

In questo caso quindi quello che si verifica è una combinazione di reazioni della glicolisi e della fase non ossidativa della via del fosfogluconato, con queste ultime nella direzione della sintesi del ribosio-5-fosfato.
Da notare che nessun metabolita torna alla glicolisi.

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I fabbisogni di ribosio-5-fosfato e NADPH si equivalgono

Se una molecola di ribosio-5-fosfato e due molecole di NADPH per molecola di glucosio-6-fosfato metabolizzata sono sufficienti a soddisfare le necessità metaboliche della cellula, quello che si verifica sono le prime quattro reazioni della via del pentoso fosfato, ossia l’intera fase ossidativa, più la reazione catalizzata dalla ribosio-5-fosfato isomerasi.
La reazione complessiva è:

Glucosio-6-fosfato + 2 NADP+ + H2O → Ribosio-5-fosfato + 2 NADPH + 2 H+ + CO2

Anche in questa condizione metabolica nessun metabolita torna alla glicolisi.

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